HPV的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展研究

王衛(wèi)芳 李家磊 賈克利 胡淼 賀志安

[摘 要] 目前宮頸癌是成年女性的常見(jiàn)癌癥。本著關(guān)愛(ài)女性健康，使學(xué)生熟練的掌握宮頸癌的“原兇”HPV即人類乳頭瘤病毒的原則，以HPV分子生物學(xué)檢測(cè)手段為例，系統(tǒng)地梳理了HPV分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。以社會(huì)需求為導(dǎo)向，在教學(xué)過(guò)程中加入實(shí)踐案例，豐富教學(xué)過(guò)程，彰顯分子生物學(xué)檢驗(yàn)在臨床實(shí)踐應(yīng)用中的重要地位，提高學(xué)生的積極性，樹立檢驗(yàn)學(xué)生仁心仁術(shù)的專業(yè)理念，培養(yǎng)“四位一體”的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)應(yīng)用型人才。

[關(guān)鍵詞] HPV;宮頸癌;分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù);應(yīng)用型人才

[基金項(xiàng)目] 2017年度新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院校級(jí)教改課題重點(diǎn)項(xiàng)目“新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，供給側(cè)改革下校企聯(lián)合培養(yǎng)‘醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工程師模式的探索與實(shí)踐”（20602008）

[作者簡(jiǎn)介] 王衛(wèi)芳（1990—），女，河南太康人，碩士，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院助教，主要從事細(xì)胞免疫學(xué)研究。

[中圖分類號(hào)] G642? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ?[文章編號(hào)] 1674-9324（2021）17-0034-04? ? [收稿日期] 2021-01-16

在新醫(yī)科背景下，以人工智能、大數(shù)據(jù)為代表的新一輪科技革命和產(chǎn)業(yè)變革推動(dòng)著醫(yī)學(xué)發(fā)展進(jìn)入新階段，對(duì)原有醫(yī)學(xué)專業(yè)提出了新要求。高等醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教育必須樹立“優(yōu)化服務(wù)生命全周期，健康全過(guò)程”的新醫(yī)學(xué)理念[1]，構(gòu)建“醫(yī)教融合、注重人文、強(qiáng)化實(shí)踐、校企協(xié)同”四位一體、能力本位的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)應(yīng)用型人才培養(yǎng)新模式。為提升醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)技術(shù)人才崗位適應(yīng)能力，本文以引起女性宮頸癌及宮頸組織癌前病變的重要因素——HPV（human papillomavirus，人類乳頭瘤病毒）為目標(biāo)，對(duì)其分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)的分析及梳理，對(duì)HPV的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行匯總，體現(xiàn)了HPV臨床篩查的重要意義，樹立醫(yī)者仁心的情感理念。

在臨床上，宮頸癌是癌癥中最早確定的由單一原因引發(fā)的，主要原因是由HPV感染引起的，多發(fā)于女性，因此定期做HPV的檢測(cè)是十分必要的。HPV病毒為球形，直徑約0.045～0.055nm，無(wú)包膜，為環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)[2]。有超過(guò)200種不同類型的HPV，其中超過(guò)51種感染生殖器上皮，約14種被歸類為高風(fēng)險(xiǎn)類型，更常見(jiàn)于宮頸癌。在疾病發(fā)展過(guò)程中，高風(fēng)險(xiǎn)類型具有截短的非復(fù)制性生命周期的趨勢(shì)增加;而低風(fēng)險(xiǎn)、非癌癥相關(guān)的HPV類型要么無(wú)癥狀，要么會(huì)導(dǎo)致良性病變，從而完成其完整的復(fù)制性生命周期（如圖1）[3，4]。據(jù)有關(guān)調(diào)查報(bào)告顯示，2018年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)表明，全球約有57萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例[5]，死于宮頸癌的女性約有31.1萬(wàn)名[6]。臨床中對(duì)確診宮頸癌患者的癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)都可以檢測(cè)到HPV[7]。2008年哈拉爾德·楚爾豪森獲得諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)，他的研究成果中闡明了HPV的感染路徑、可能入侵部位以及病毒增殖傳播和引發(fā)宮頸癌的全部過(guò)程[8]。這一研究成果為HPV的檢測(cè)奠定了重要理論基礎(chǔ)。

現(xiàn)階段HPV檢測(cè)主要以分子生物學(xué)的方法為主，以其蛋白質(zhì)、核酸為研究對(duì)象。在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，主要表現(xiàn)在對(duì)HPV的基因鑒定、核酸檢測(cè)以及其表達(dá)產(chǎn)物的檢驗(yàn)分析[9]，如直接分子雜交檢測(cè)技術(shù)、PCR分子檢測(cè)技術(shù)、新興檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。

一、直接分子雜交檢測(cè)技術(shù)

原位雜交利用了核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使探針DNA和目的基因結(jié)合成雜交分子，可在組織或細(xì)胞中定位到HPV的DNA。該項(xiàng)技術(shù)能定位可疑DNA的具體位置，具有特異性強(qiáng)、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，但是該檢測(cè)方法對(duì)樣本的質(zhì)量要求較高，需要耗費(fèi)大量勞動(dòng)力和高額的成本，因此現(xiàn)階段無(wú)法大量在臨床中開(kāi)展。

二、PCR分子檢測(cè)技術(shù)

（一）DNA測(cè)序法（DNA sequencing）

DNA測(cè)序是對(duì)PCR產(chǎn)物的堿基序列對(duì)進(jìn)行分析，然后將測(cè)序產(chǎn)生的結(jié)果與DNA文庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，辨別HPV的分型。DNA測(cè)序能夠避免多種交叉反應(yīng)，檢測(cè)出不同HPV分型，其特異性較好[ 10 ]。但是，檢測(cè)多重感染的不同序列，DNA測(cè)序法的檢測(cè)對(duì)其敏感度低，有時(shí)因混合型在測(cè)序時(shí)無(wú)法讀出序列而導(dǎo)致結(jié)果無(wú)法判斷。雖然快速測(cè)序法可對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行高通量的常規(guī)檢測(cè)，但耗時(shí)間久、費(fèi)用較貴。

（二）限制性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

該技術(shù)產(chǎn)生的大量片段，可以在凝膠電泳上辨別。因?yàn)镠PV的分型不同，所以它們的序列也各不相同。因各個(gè)基因的酶切位點(diǎn)不同，酶解產(chǎn)物不同，所以在凝膠電泳上大小與位置不同。根據(jù)在凝膠電泳上產(chǎn)生的片段來(lái)辨別高危型HPV的分型。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單且分型時(shí)間短，但對(duì)引物的要求頗高。

（三）共同引物PCR

此技術(shù)基本可以通過(guò)一次反應(yīng)檢測(cè)同類所有相關(guān)型HPV病原體，與普通PCR技術(shù)相比較，它具有的快捷、高通量的優(yōu)點(diǎn)更加明顯，使HPV的檢出率明顯提高，確保了患者的及時(shí)治療。

三、新興檢測(cè)技術(shù)

（一）流式熒光雜交法（Luminex，MAP）

此法能測(cè)出多種高危型HPV，在檢測(cè)的過(guò)程中要先將含有寡核苷酸的探針（固定有多種熒光色的乳膠顆粒）所屬的微粒分散體系混合，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，再加入Biotin標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，使得微球上的寡核苷酸探針與PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，最后加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈親和素。在反應(yīng)過(guò)程中結(jié)合為雜交體（微球—寡核苷酸探針—PCR產(chǎn)物—生物素—鏈霉親和素—聚乙烯復(fù)合物），測(cè)定時(shí)的微球會(huì)經(jīng)過(guò)兩激光，一激光確定微球上的聚乙烯，另一激光確定微球上固定的探針類型，然后可以確定標(biāo)本是否感染了對(duì)應(yīng)的HPV亞型。在一些宮頸癌篩查試驗(yàn)過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)流式熒光雜交法具有高速度、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[ 11，12 ]。

（二）實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（real-timequantitative PCR，RT-PCR）

熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在寡聚核苷酸引物作用下的模板DNA，通過(guò)“變性—退火—延伸—合成”周期的多次循環(huán)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物急劇積累，可通過(guò)線性關(guān)系來(lái)進(jìn)行分析[ 13 ]。該法可對(duì)HPV16型和18型進(jìn)行定量分析檢測(cè)，具有高特異性和高準(zhǔn)確性。該技術(shù)把基因擴(kuò)增和結(jié)果分析放到單管密閉環(huán)境中，避免了污染和不能定量的問(wèn)題，是測(cè)定HPV的極好方式。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科用此法對(duì)424例門診患者陰道分泌物中HPV的8個(gè)基因型（HPV16、18、31、33、45、52、56、58型）進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析之后發(fā)現(xiàn)，這種方法操作簡(jiǎn)練、反應(yīng)迅速[ 14 ]。目前，這種方法的應(yīng)用較廣泛。

四、結(jié)論

宮頸癌作為女性健康的“殺手”，主要原因就是由HPV感染引起的，因此女性應(yīng)有意識(shí)定期檢測(cè)HPV，并且在條件允許的情況下，接種HPV疫苗。Anne Hammer的研究表明，HPV能夠在人子宮宮頸中建立潛伏期[ 15 ]。周萍的研究表明HPV感染陽(yáng)性率隨宮頸病變程度的加重而增高[ 16 ]。因此HPV檢測(cè)為宮頸癌早預(yù)防、早診斷、精準(zhǔn)分型和治療提供了完整的解決方案。HPV可分高危型和低危型。研究表明，高危型HPV的持續(xù)性感染引起的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)更高，所以對(duì)其檢測(cè)更有意義。而HPV分子檢測(cè)能夠檢測(cè)HPV分型，因此HPV分子檢測(cè)技術(shù)正逐步取代傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。我國(guó)HPV的分子檢測(cè)目前出現(xiàn)了很多新型技術(shù)，如高端的液態(tài)芯片技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)等，這些新興技術(shù)會(huì)成為一種新的趨勢(shì)。

國(guó)家相關(guān)政策規(guī)定，對(duì)沒(méi)有做過(guò)宮頸癌檢測(cè)的農(nóng)村婦女進(jìn)行免費(fèi)篩查，加強(qiáng)大眾對(duì)宮頸癌的認(rèn)識(shí)并進(jìn)行積極的預(yù)防和治療。另外多項(xiàng)研究表明，使用免疫抑制劑的免疫缺陷人群發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)有所提高[ 17 ]。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展、不斷進(jìn)步、不斷成熟，使得更多的HPV的高風(fēng)險(xiǎn)類型得到檢測(cè)并且能夠?qū)⑵渚唧w分型，極大地提高了HPV檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度，大大地增加了臨床檢出率。

總而言之，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)是一門跨臨床、理學(xué)、工學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的多學(xué)科交叉專業(yè)，學(xué)科發(fā)展迅速、新技術(shù)應(yīng)用極多。為了準(zhǔn)確把握醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用型人才崗位勝任力的內(nèi)涵，構(gòu)建應(yīng)用型醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)人才的課程體系，需明確各課程在專業(yè)教學(xué)中的地位和作用，在新醫(yī)科背景下，伴隨著教育改革的蓬勃發(fā)展，臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)由于其所具有的技術(shù)性、理論性以及實(shí)踐性，作為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要分支，一方面需要任課教師在教學(xué)科研臨床共相長(zhǎng)，另一方面要提升學(xué)生對(duì)該課程的關(guān)注度。師生共同努力與時(shí)俱進(jìn)，培養(yǎng)“四位一體”的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)應(yīng)用型人才。

參考文獻(xiàn)

[1]教育部，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家中醫(yī)藥管理局.關(guān)于加強(qiáng)醫(yī)教協(xié)同實(shí)施卓越醫(yī)生教育培養(yǎng)計(jì)劃2.0的意見(jiàn)[N].中華人民共和國(guó)教育部公報(bào)，2018-09-17.

[2]宋國(guó)興.子宮頸癌致病因子人乳頭瘤病毒的發(fā)現(xiàn)——

2008年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)成果簡(jiǎn)介[J].科技導(dǎo)報(bào)，2008，26（24）：31-36.

[3]Doorbar，J.Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer.Clin.Sci.2006，110（5）：525-541.

[4]Ian N Hampson，Anthony W Oliver，et al.Potential Effects of Human Papillomavirus Type Substitution， Superinfection Exclusion and Latency on the Efficacy of the Current L1 Prophylactic Vaccines[J].Viruses，2020，13（1）：E22.doi：10.3390/v1

3010022.

[5]Ferlay J， Ervik M，et al.Global，Regional， and National Cancer Incidence， Mortality， Years of Life Lost， Years Lived With Disability， and Disability-Adjusted Life-Years for 29 Cancer Groups，1990 to 2017：A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study[J].JAMA Oncology.2019，5（12）：1749

-1768.

[6]張春嬌，仲崇明.人乳頭狀瘤病毒感染及其易感因素的分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2019，29（19）：2421-2423.

[7]Chen W， Zhang X， et al. Human papillomavirus type-distribution in cervical cancer in China[J].Cancer Causes&Control，2015，20（9）：1705-1713.

[8]Harald zur Hausen.Papillomaviruses and cancer：from basic studies to clinical application. 2002，2（Suppl.5）：342-350.

[9]白雪，盛楠，鄒秉杰，等.人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，17（34）：6785-6788.

[10]洪蝶，陳懷增.人乳頭瘤病毒基因型檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，27（1）：58-60.

[11]Tang Y， Lan Z ， et al. Epidemiology and genotype distribution of human papillomavirus（HPV） in Southwest China： a cross-sectional five years study in non-vaccinated Women[J].Virology Journal，2017，14（1）：84.

[12]Lu J， Shen G ，et al. Genotype distribution characteristics of multiple human papillomavirus in woman from the Taihu River Basin on the coast of eastern China[J]. Bmc Infectious Diseases2017，17（1）：226.

[13]王瑋，魯清月，李振紅，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本的前處理方法研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（3）：333-335.

[14]曹海燕，梁紅艷，趙彩鳳，等.運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)424例患者HPV結(jié)果分析[J].黑龍江醫(yī)學(xué)雜志，2010，34（7）：526-527.

[15]Anne Hammer， Maurits NC de Koning，et al.Whole tissue cervical mapping of HPV infection： Molecular evidence for focal latent HPV infection in humans[J].Papillomavirus Research，2019（7）：82-87.

[16]周萍，隗伏冰.東莞市免費(fèi)宮頸癌篩查HPV感染分布特點(diǎn)及與宮頸病變的結(jié)果分析[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，

2020，14（12）：72-72.

[17]謝文娟，劉玉林，范愛(ài)萍，等.免疫缺陷人群宮頸癌篩查進(jìn)展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2020，29（5）：392-393.

Research on the Development of HPV Molecular Biology Test Technology

WANG Wei-fang1， LI Jia-lei1， JIA Ke-li1， HU Miao1， HE Zhi-an2

（1. Department of Medical Laboratory， Sanquan College， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003， China; 2. Department of Medical Laboratory， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003， China）

Abstract：Cervical cancer is a common cancer in adult women nowadays. In line with the principle of caring for womens health and making students skillfully learn about the “origin culprit” of cervical cancer — HPV（the human papilloma virus）， this paper takes HPV molecular biology test methods as an example， systematically combs the HPV molecular biology test technologies. Guided by the current social needs， we should add practical cases in the teaching process， enrich the teaching process， highlight the important position of the application of molecular biology test in clinical practice， improve the enthusiasm of students， establish the professional concept of testing students benevolence in the cultivation， and train “four-in-one” applied talents of medical test technology.

Key words： HPV; cervical cancer; molecular biology test technology; applied talents