石蒜堿誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

李吉業(yè)，張 晶，于 淼,2，劉 斌，辛國(guó)松,2*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076；2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

惡性腫瘤已經(jīng)嚴(yán)重威脅中國(guó)人群健康，根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，近十幾年來惡性腫瘤的發(fā)病死亡均呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)，防控形勢(shì)嚴(yán)峻.目前在臨床上癌癥治療主要有阿霉素等藥物，治療后復(fù)發(fā)幾率很高，其中重要的原因就是由于化療過程中腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生.阿霉素屬于廣譜抗癌藥物，主要通過破壞DNA從而發(fā)揮藥效.目前在治療腫瘤方面，阿霉素與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用被認(rèn)為高效的化療藥物.化療藥物發(fā)生藥效的同時(shí)，對(duì)肝臟、腎臟、心臟以及神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用，加大藥物劑量的同時(shí)并不能更好的達(dá)到效果，從而很大程度的降低了生物利用度.研究表明石蒜堿具有抗腫瘤作用.石蒜堿是存在于石蒜科植物石蒜鱗莖內(nèi)的生物堿[1-2].石蒜堿具有右旋光性，不溶于水，難溶于乙醇和乙醚[3].石蒜堿經(jīng)口給藥或皮下注射有流涎、抑制心率及增加氣管分泌的作用，故在一些時(shí)候曾用其制劑作祛痰劑[4].石蒜堿還有較顯著的催吐作用.石蒜堿是生物學(xué)活性較強(qiáng)的生物堿，在臨床上石蒜堿具有廣泛的藥理作用，主要有抗腫瘤、抗炎、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用等[5-6].有研究認(rèn)為，石蒜堿對(duì)肝癌具有抗腫瘤作用[7]，而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株具有敏感性，是目前腫瘤化療研究的熱點(diǎn)藥物之一，具有廣泛的應(yīng)用前景[8].本文主要是對(duì)石蒜堿抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行研究[9-10]，為今后石蒜堿的深入研究開發(fā)與臨床應(yīng)用提供參考.

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG-2細(xì)胞株由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心提供.

1.2 藥物與實(shí)驗(yàn)試劑

羥基喜樹堿(哈爾濱圣泰藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)；青藤堿(阿拉丁試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)；總膽固醇測(cè)定試劑盒(浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)；唾液酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞膜流動(dòng)性DPH熒光偏振檢測(cè)試劑盒(貝博生物技術(shù)有限公司)；ATP酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(浙江杭天生物科技公司)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、CCK-8試劑(美國(guó) GIBCO 公司)；醫(yī)用酒精(山東利爾康消毒試劑股份有限公司)；氯化鉀、氯化鈉(北京化學(xué)試劑公司)；磷酸二氫鉀(萊陽化工實(shí)驗(yàn)廠)；磷酸二氫鈉(汕頭金紗化工廠)；甲醇(天津天利化學(xué)試劑有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、熒光探針鈣黃綠素/AM-氯化鈷、羅丹明123熒光探針、兔抗Cytchrome C多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)、Caspase-3試劑盒、核糖核酸酶A、PMSF、Western及IP細(xì)胞裂解夜、30%Acr-Bis、TEMED(碧云天生物技術(shù)研究所)；Tween-20(美國(guó)Amresco公司)；乙醇(95%)(山東銀舟化工有限公司)；Triton-X-100(Farco公司)；枸櫞酸鈉(北京化學(xué)試劑公司)；碳酸氫鈉(天津巴斯夫化工有限公司)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)；SDS(美國(guó)Sigma公司)；封閉用脫脂奶粉(LEAGENE公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

醫(yī)用型超凈工作臺(tái)(DL-CJ-1N)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；ECO-170P-230型二氧化碳培養(yǎng)箱、Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)NBS公司)；熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；流式細(xì)胞儀(EPICS-XL)(美國(guó)Beckman-Coulter公司)；CKX-41-32型倒置顯微鏡、C-4040ZOOM 型數(shù)碼相機(jī)(日本OLYMPUS公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-5800)(美國(guó)METASH公司)；低速離心機(jī)(Anke TDL80-2C)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman-Coulter公司)；TS-1000震蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)有限公司)；Adventurer萬分之一電子天平(美國(guó)Ohous公司)；P型微量移液器(法國(guó)Gilson公司)；電泳儀、垂直電泳轉(zhuǎn)印槽(北京六一儀器廠)；Tannon凝膠成像系統(tǒng)GIS-2019(天能科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)METASH公司).

2 石蒜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞抗腫瘤作用的研究

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG-2細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中，在5% CO2、37 ℃條件下，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，用0.25%胰酶消化液消化，然后將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，如用于實(shí)驗(yàn)可以收集細(xì)胞.

2.2 MTT法檢測(cè)石蒜堿的生長(zhǎng)抑制作用

將處于對(duì)數(shù)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的96孔板，每孔100 μL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，向96孔板中加入藥液，每孔100 μL，并且每個(gè)給藥組設(shè)置6個(gè)平行樣，石蒜堿給藥組設(shè)置5個(gè)給藥量，陽性給藥組給予3個(gè)劑量的羥基喜樹堿，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，去除96孔板中上層清液，然后向每孔加入質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 100 μL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)4 h后，去除上清液，向96孔板中加入DMSO溶液，每孔200 μL，使用微型振蕩器振蕩，時(shí)間5 min，然后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為570 nm，計(jì)算IC50.

細(xì)胞抑制率% =

2.3 倒置顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)

將處于對(duì)數(shù)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔1 mL，石蒜堿給藥濃度分為低中高三個(gè)劑量組，劑量分別為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下拍照觀察.

2.4 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

將處于對(duì)數(shù)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔1 mL，石蒜堿給藥濃度分為低中高三個(gè)劑量組，劑量分別為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，倒掉培養(yǎng)液，加入多聚甲醛溶液1 mL，4 ℃條件下固定1 h，PBS清洗液清洗細(xì)胞，避光使用Hoechst33258染色液染色30 min，熒光顯微鏡下拍照觀察.

2.5 石蒜堿對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡率變化的影響

取出正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低中高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將收集細(xì)胞用事先在-20 ℃條件下預(yù)冷的70%乙醇溶液固定，固定條件為4 ℃，固定時(shí)間為24 h，然后利用離心機(jī)離心，去除上層固定液，再使用PBS溶液反復(fù)離心洗滌3次，最后向收集的細(xì)胞中加入800 μL PI 染液染色，在室溫條件下避光孵育，時(shí)間為30 min，然后用300目網(wǎng)過濾染色細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè).

3 石蒜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能影響的研究

3.1 檢測(cè)人肝癌HepG-2細(xì)胞膜含總蛋白量變化情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，最后向溶液中再加入10 mL蒸餾水后，離心機(jī)離心2次，去除上層清液，最終獲得沉淀的腫瘤細(xì)胞膜，將其收集用生理鹽水懸浮待用.檢測(cè)按試劑盒說明操作.

3.2 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，最后向溶液中再加入10 mL蒸餾水后，離心機(jī)離心2次，去除上層清液，最終獲得沉淀的腫瘤細(xì)胞，將其收集用生理鹽水懸浮待用.檢測(cè)按含膽固醇量檢測(cè)試劑盒說明操作.

3.3 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜含唾液酸量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，最后向溶液中再加入10 mL蒸餾水后，離心機(jī)離心2次，去除上層清液，最終獲得沉淀的腫瘤細(xì)胞，將其收集用生理鹽水懸浮待用.檢測(cè)按含唾液酸量檢測(cè)試劑盒說明操作.

3.4 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，最后向溶液中再加入10 mL蒸餾水后，離心機(jī)離心2次，去除上層清液，最終獲得沉淀的腫瘤細(xì)胞，將其收集用生理鹽水懸浮待用.熒光分光光度計(jì)檢測(cè).

3.5 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜封閉度的影響研究

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，制成不封閉影泡.采用Zamudio法，測(cè)定細(xì)胞膜的封閉度.

3.6 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜陽離子通道活性的影響的研究

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，利用胰蛋白酶快速消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將HepG-2細(xì)胞稀釋調(diào)節(jié)濃度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞混懸液，取出事先滅菌的6孔板，每孔1 mL接種，放入培養(yǎng)箱中，溫度37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，給藥，每孔加入1 mL藥液，石蒜堿分為低、中、高三個(gè)劑量組，給藥劑量為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照組為濃度4 μmol/L羥基喜樹堿1 mL，陰性對(duì)照組給予RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞用蒸餾水混勻并且低滲條件進(jìn)行破膜處理，時(shí)間為1 h，離心取上清腫瘤細(xì)胞膜，ATP酶活性試劑盒進(jìn)行檢測(cè).

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

4.1 利用MTT實(shí)驗(yàn)考察石蒜堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2的增殖抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人肝癌HepG-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的石蒜堿作用后，均表現(xiàn)出一定的增殖抑制作用，說明石蒜堿對(duì)HepG-2具有增殖抑制作用，經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析發(fā)現(xiàn)，石蒜堿的增殖抑制作用在一定范圍內(nèi)，與石蒜堿給藥劑量正相關(guān)性.并計(jì)算得出IC50為5.73 μmol/L.后續(xù)實(shí)驗(yàn)參考IC50，設(shè)定低、中、高三個(gè)給藥劑量組，劑量分別為3、6、12 μmol/L，陽性對(duì)照羥基喜樹堿劑量設(shè)定為4 μmol/L.見表1.

表1 石蒜堿對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖抑制作用

4.2 觀察石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化情況

在實(shí)驗(yàn)過程中，將HepG-2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，給藥48 h后發(fā)現(xiàn)，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況，陰性對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁生長(zhǎng)，外形輪廓清晰；陽性對(duì)照羥基喜樹堿組細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，可見大多數(shù)細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，石蒜堿給藥組，隨著石蒜堿給藥劑量的加大，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，且越發(fā)呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，高劑量這種作用最為明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂現(xiàn)象.見圖1.

圖1 倒置顯微鏡觀察HepG-2細(xì)胞形態(tài)(10×40倍)

4.3 利用熒光顯微鏡觀察石蒜堿作用人肝癌細(xì)胞HepG-2后形態(tài)學(xué)變化情況

藥物作用HepG-2細(xì)胞48 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，整體輪廓清晰完整，細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻熒光，陽性對(duì)照羥基喜樹堿組細(xì)胞，外膜明顯破裂，細(xì)胞核縮小，細(xì)胞整體輪廓模糊，石蒜堿給藥組，三個(gè)劑量均能發(fā)現(xiàn)凋亡小體，且細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，細(xì)胞核呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光，且隨石蒜堿給藥濃度增加，現(xiàn)象越明顯.見圖2.

圖2 石蒜堿作用HepG-2細(xì)胞后細(xì)胞凋亡形態(tài)(10×40倍)

4.4 石蒜堿誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡率變化情況

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞72 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組凋亡率為(18.53±0.07)%，石蒜堿低、中、高劑量組，凋亡率分別為(7.77±0.13)%、(10.59±0.26)%、(12.95±0.14)%，細(xì)胞凋亡率隨著石蒜堿給藥濃度的增加而增加，且呈劑量依賴性關(guān)系，各給藥組細(xì)胞凋亡率與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見圖3，表2.

圖3 石蒜堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的凋亡率影響

表2 石蒜堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的凋亡率影響

4.5 石蒜堿對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞膜蛋白含量的影響

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜含蛋白量變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組腫瘤細(xì)胞膜含總蛋白量為(1.039±0.032)g/L，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜含總蛋白量為(1.368±0.027)g/L，石蒜堿低、中、高劑量組，腫瘤細(xì)胞膜含總蛋白量分別為(1.129±0.025)g/L，(0.971±0.006)g/L，(0.334±0.026)g/L，腫瘤細(xì)胞膜含總蛋白量隨著石蒜堿給藥濃度的增加而減少，且與劑量呈負(fù)相關(guān)性，各給藥組腫瘤細(xì)胞膜含總蛋白量與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表3，圖4、5.

圖4 石蒜堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的凋亡率影響

表3 石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞膜含總蛋白量變化情況

圖5 石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞膜總蛋白含量變化情況

4.6 石蒜堿作用HepG-2腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度變化情況

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度為(1.575±0.047)mmol/L，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度為(3.600±0.036)mmol/L，石蒜堿低、中、高劑量組，腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度分別為(2.438±0.059)mmol/L，(1.851±0.073)mmol/L,(1.219±0.061)mmol/L，腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度隨著石蒜堿給藥的增加而減少，且與劑量呈負(fù)相關(guān)性，各給藥組腫瘤細(xì)胞膜唾液酸濃度與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表4，圖6.

表4 石蒜堿對(duì)人腫瘤細(xì)胞膜唾液酸的影響

圖6 石蒜堿對(duì)人腫瘤細(xì)胞膜唾液酸的影響

4.7 石蒜堿作用HepG-2腫瘤細(xì)胞膜膽固醇含量變化情況

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量為(3.119±0.080)mol/L，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量為(5.903±0.082)mol/L，石蒜堿低、中、高劑量組，腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量分別為(5.459±0.053)mol/L，(4.230±0.048)mol/L，(3.084±0.055)mol/L，腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量隨著石蒜堿給藥濃度的增加而減少，且與劑量呈負(fù)相關(guān)性，各給藥組腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表5，圖7.

表5 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜含膽固醇量的影響

圖7 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜膽固醇含量的影響

4.8 石蒜堿作用HepG-2腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化情況

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性為4.087±0.352，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性為5.533±0.462，石蒜堿低、中、高劑量組，腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性分別為4.738±0.243，4.110±0.193，3.464±0.142，腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性隨著石蒜堿給藥濃度的增加而降低，且與劑量呈負(fù)相關(guān)性，各給藥組腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表6，圖8.

表6 石蒜堿對(duì)人腫瘤細(xì)胞膜的流動(dòng)性的影響

圖8 石蒜堿對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

4.9 石蒜堿作用HepG-2腫瘤細(xì)胞膜封閉度的變化情況

石蒜堿作用人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞膜封閉度變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照羥基喜樹堿組腫瘤細(xì)胞膜封閉度為(14.18±0.56)%，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜封閉度為(20.09±0.11)%，石蒜堿低、中、高劑量組，腫瘤細(xì)胞膜封閉度分別為(17.59±0.24)%，(14.29±0.33)%，(6.28±0.28)%，腫瘤細(xì)胞膜封閉度隨著石蒜堿給藥濃度的增加而降低，且與劑量呈負(fù)相關(guān)性，各給藥組腫瘤細(xì)胞膜封閉度與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表7，圖9.

表7 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜封閉度的影響

圖9 石蒜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞膜封閉度的影響

4.10 石蒜堿對(duì)HepG-2腫瘤細(xì)胞膜Na+，K+-ATPase活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜Na+，K+-ATPase活性為(9.635±0.080)μmol/mg/h，石蒜堿低、中、高給藥組Na+，K+-ATPase活性分別為(6.494±0.041)μmol/mg/h，(3.913±0.048)μmol/mg/h，(1.632±0.030)μmol/mg/h；陽性對(duì)照組Na+，K+-ATPase活性為(3.521±0.073)μmol/mg/h.石蒜堿各給藥組與陰性對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01).結(jié)果說明,石蒜堿可以降低腫瘤HepG-2細(xì)胞膜Na+，K+-ATPase活性，腫瘤細(xì)胞陽離子通道活性降低使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，腫瘤細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂.見表8，圖10.

表8 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

圖10 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

4.11 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜陽離子通道Ca2+，Mg2+-ATPase活性的影響

結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組腫瘤細(xì)胞膜Ca2+，Mg2+-ATPase活性為(2.816±0.024)μmol/mg/h，石蒜堿低、中、高給藥組Ca2+，Mg2+-ATPase活性分別為(2.271±0.055)μmol/mg/h，(1.277±0.033)μmol/mg/h，(0.341±0.035)μmol/mg/h.陽性對(duì)照組Ca2+，Mg2+-ATPase活性為(0.764±0.030)μmol/mg/h.石蒜堿各給藥組與陰性對(duì)照組比較，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見表9，圖11.

表9 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

圖11 石蒜堿對(duì)腫瘤細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

5 討 論

我國(guó)有豐富的石蒜屬野生品種，在石蒜堿的開發(fā)利用上占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)[11].目前，針對(duì)石蒜堿的藥理活性及作用機(jī)制的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展.近年來有研究表明，石蒜堿對(duì)多種腫瘤有抑制作用[12-13].多細(xì)胞生物的細(xì)胞增殖和死亡平衡使機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)[14].而細(xì)胞的死亡形式有多種，包括壞死、凋亡、自噬等等.凋亡是生理?xiàng)l件下機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[15].腫瘤細(xì)胞的無限增殖與凋亡異常密切相關(guān)[16].上述實(shí)驗(yàn)說明，石蒜堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞具有抗腫瘤作用[17]，并且石蒜堿可通過降低腫瘤細(xì)胞膜表面的含總蛋白量、唾液酸濃度以及含總膽固醇量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞細(xì)胞膜完整性[18]，主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞膜流動(dòng)性、膜封閉度顯著降低，由于腫瘤細(xì)胞膜的主要組成成分含量的下降及基本膜結(jié)構(gòu)功能的改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜表面離子通道 Na+，K+-ATP酶活性、Ca2+，Mg2+-ATP酶活性降低[19]，從而改變了腫瘤細(xì)胞膜與細(xì)胞外環(huán)境間進(jìn)行的物質(zhì)交換，腫瘤細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，胞內(nèi)離子環(huán)境失衡，這些變化進(jìn)一步會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞膜內(nèi)外能量傳遞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞膜功能障礙而引起腫瘤發(fā)生凋亡[20].