Tb3+修飾的MOF熒光探針的制備及L-色氨酸識別性能

高新麗，裴 雷，趙旭東，高竹青，黃宏亮

(1 太原科技大學 分析測試中心，太原 030024；2 太原科技大學化學與生物工程學院，太原 030024；3 天津工業(yè)大學 化學與化工學院，天津 300387；4 天津工業(yè)大學 省部共建天津工業(yè)大學分離膜和膜過程國家重點實驗室，天津 300387)

氨基酸是生物體蛋白質、多肽的主要成分，也是生物代謝過程中輔酶和核酸的前驅體，是人體不可或缺的分子[1]。氨基酸的含量直接關系到人體的健康，過多或過少均會誘發(fā)一些疾病(如癌癥、白血病等)[2-3]。其中，色氨酸(Trp)參與調節(jié)蛋白質的合成，促進人體消化，同時作為神經(jīng)遞質的前體，能有效調控情緒、改善睡眠。一些腎功能衰竭、神經(jīng)性及免疫性等疾病往往伴隨Trp的代謝紊亂[4]。為了實現(xiàn)疾病的及時預防和早期診斷，氨基酸的快速靈敏檢測具有重要的意義。目前，已報道的檢測方法包括高效液相色譜法、毛細管電泳法、質譜法、電化學實驗法等[5-8]。此類方法存在成本高、程序復雜、檢測耗費時間長、不易通過肉眼識別等問題。與之相比，熒光分析法具有快速響應、選擇性和靈敏性高等優(yōu)點，在生物傳感技術領域體現(xiàn)出良好的發(fā)展?jié)摿ΑＲ虼?，有必要開發(fā)高效的熒光探針材料，以實現(xiàn)氨基酸的高效檢測。目前，基于主客體氫鍵作用、π-π堆疊作用、有機反應、紫外光競爭等機理，已經(jīng)有幾類Trp熒光探針被報道，如BTAP5、石墨烯-羅丹明復合物、芘二酮、金屬-有機骨架材料(metal-organic framework,MOF)等[9-13]，然而材料的選擇性、靈敏度等指標仍有待提升。

近些年來，作為一種由金屬和有機配體組成的多孔骨架材料，MOFs已被廣泛應用于吸附分離[14]、催化[15]、藥物傳輸[16]、熒光檢測[17]等方面，在環(huán)境工程和生物健康等領域發(fā)揮著重要作用。豐富的發(fā)光體系、可設計的成鍵位點及良好的骨架穩(wěn)定性，使得熒光MOF材料具備良好的傳感性能。目前，MOF材料已被應用于多種氨基酸的熒光識別，包括半胱氨酸(Cys)[17-18]、高半胱氨酸(GSH)[19]、組氨酸(His)[20]、谷氨酸(Glu)[21]、天冬氨酸(Asp)[22]等。對于Trp的檢測，盡管已有MOF材料被報道[12-13,23-25]，然而材料的檢測性能特別是檢測限方面仍有待提高。另外，在熒光MOFs方面，鑭系MOFs因其優(yōu)異的光學性質如大Stoke位移、高色純度以及相對較長的熒光壽命而受到了廣泛的關注。其中，利用后合成修飾法在一些MOF材料上負載鑭系金屬元素已成為近年來在鑭系MOF制備方面的重要途徑之一，而MOF材料中的螯合基團如羧基[26]、吡啶[27]、氨基[28]等為具有發(fā)光特性的鑭系離子提供了有效的負載位點。

本工作以羧基化的鋯基材料UiO-66-(COOH)2為平臺，利用后合成修飾法負載鋱制備熒光探針。良好的水穩(wěn)定性、生物相容性及材料配體中豐富的羧基基團，使得該MOF可作為良好的鑭系金屬(如Tb3+)負載基底材料。并進一步探索了Tb3+@UiO-66-(COOH)2對Trp檢測的靈敏度、響應時間及抗干擾能力，并對熒光檢測機制進行了研究。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：四氯化鋯(ZrCl4)，1,2,4,5-均苯四甲酸(H4BTEC)，六水硝酸鋱(Tb(NO3)3·6H2O)，羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，L-丙氨酸(L-Ala)，L-天冬酰胺(L-Asn)，L-半胱氨酸(L-Cys)，L-谷氨酰胺(L-Gln)，L-甘氨酸(L-Gly)，L-異亮氨酸(L-Ile)，L-亮氨酸(L-Leu)，L-甲硫氨酸(L-Met)，L-脯氨酸(L-Pro)，L-絲氨酸(L-Ser)，L-蘇氨酸(L-Thr)，L-纈氨酸(L-Val)，L-色氨酸(L-Trp)等均購自北京華威銳科化工有限公司。所購試劑直接使用而沒有進行進一步的純化。

主要儀器：MiniFlexⅡ X射線衍射儀；3H-2000PS1/2系列全自動比表面及孔徑分析儀；F-200場發(fā)射透射電子顯微鏡；Nicolet iS50傅里葉變換紅外分光光度計；UV-6000型紫外/可見分光光度計；Fluoromax-4熒光光譜儀；X射線光電子能譜儀。

1.2 樣品制備

UiO-66-(COOH)2制備：該材料的合成參考文獻[29]報道的方法。在100 mL圓底燒瓶中加入4.3 g H4BTEC,2.3 g ZrCl4和50 mL去離子水，充分攪拌后在100 ℃下回流反應24 h。為防止未反應的均苯四甲酸的析出，趁熱過濾收集白色固體。進一步將所得固體分散于200 mL去離子水中，在100 ℃下二次回流，以清洗產物中殘留的配體和金屬。最后，將所得固體在100 ℃下干燥24 h。

Tb3+@UiO-66-(COOH)2的制備：在500 mL圓底燒瓶中，加入0.5436 g Tb(NO3)3·6H2O和200 mL乙醇，充分溶解后加入300 mg UiO-66-(COOH)2粉末，在室溫下攪拌24 h，通過過濾收集白色固體。為了去除材料表面殘留的Tb3+，所得固體用乙醇清洗2次。最后，將得到的固體在100 ℃下烘干24 h即可。

1.3 氨基酸識別性能研究

1.3.1 選擇性實驗

以HEPES緩沖液(20 mmol/L，pH值為7.4)為溶劑配制濃度均為10 mmol/L的不同種類氨基酸溶液。取3 mL溶液加入4 mL的聚丙烯(PP)塑料管中，并加入3 mg Tb3+@UiO-66-(COOH)2固體樣品，超聲處理后在室溫下陳化12 h，然后進行熒光光譜測試。實驗所用的激發(fā)波長為322 nm，所用狹縫均為2.5 nm。

1.3.2 濃度影響實驗

用上述HEPES緩沖液作溶劑，分別配制濃度為1×10-5,2×10-5,4×10-5,6×10-5,8×10-5,1×10-4,1×10-3,1×10-2,1×10-1mol/L的Trp氨基酸溶液。取3 mL加入3 mg的固體中，超聲后陳化12 h，進行熒光光譜測試。測試條件同1.3.1。

1.3.3 動力學實驗

取3 mL濃度為 0.01 mol/L的色氨酸溶液，加入3 mg Tb3+@UiO-66-(COOH)2，超聲處理后立刻測試其熒光強度，然后每隔1 min測試其熒光強度，待熒光強度較穩(wěn)定后每隔5 min測試一次熒光強度，直至熒光強度趨于穩(wěn)定。測試條件同1.3.1。

1.3.4 抗干擾能力實驗

配制含有Trp氨基酸和另一種氨基酸的混合溶液，兩種氨基酸的濃度均為0.1 mol/L。取3 mL加入3 mg Tb3+@UiO-66-(COOH)2固體中，超聲后陳化12 h，進行熒光光譜測試。測試條件同1.3.1。

1.3.5 pH值影響實驗

以去離子水為溶劑，配制5組水溶液和5組Trp氨基酸水溶液(濃度為1×10-2mol/L)，用NaOH和鹽酸溶液調節(jié)溶液pH值為2.0，4.0，6.4，8.0，10.0。取3 mL溶液加入3 mg Tb3+@UiO-66-(COOH)2固體中，超聲后陳化12 h，進行熒光光譜測試。測試條件同1.3.1。

2 結果與分析

2.1 形貌與結構

通過對比UiO-66-(COOH)2粉末XRD與其單晶模擬XRD譜圖數(shù)據(jù)，如圖1(a)所示，發(fā)現(xiàn)兩者的出峰位置較為一致，同時粉末XRD峰形尖銳，證明了基底材料的成功制備。在負載Tb3+之后，樣品的XRD譜圖并未有明顯變化，說明了Tb3+@UiO-66-(COOH)2

圖1 材料的表征(a)粉末和模擬XRD譜圖；(b)紅外光譜圖；(c)Tb4d的XPS譜圖；(d)77 K下N2吸附-脫附曲線圖Fig.1 Characterization of materials(a)XRD of power and simulation;(b)FTIR spectra;(c)XPS of Tb4d region;(d)N2 adsorption-desorption isotherms at 77 K

具有和原始材料相同的拓撲結構。在紅外光譜中(圖1(b))，1705 cm-1處的峰對應于自由羧基的振動峰，配位羧基峰(—COO—Zr)的對稱伸縮振動和不對稱伸縮振動分別位于1397 cm-1和1587 cm-1，均來源于UiO-66-(COOH)2材料配體中的羧基基團；負載Tb3+后，自由羧基峰被明顯削弱，同時配位羧基峰的位置也發(fā)生了明顯的偏移(1556 cm-1和1381 cm-1)，該結果共同表明了自由羧基和Tb3+的配位。進一步地，對比圖1(c)的XPS譜圖黑線和藍線，可以明顯發(fā)現(xiàn)Tb3+@UiO-66-(COOH)2中含有Tb4d的峰，確認了Tb元素在樣品中的存在。材料的多孔性通過77 K下氮氣吸附-脫附曲線確定。經(jīng)計算，UiO-66-(COOH)2的比表面積為418 m2/g，而對應于Tb3+@UiO-66-(COOH)2的數(shù)值為343 m2/g。負載Tb之后，材料仍具有良好的孔道性質。

圖2為材料的TEM形貌圖?？梢钥闯鯱iO-66-(COOH)2材料由35 nm左右的不規(guī)則顆粒組成，與之前報道類似[30]；負載Tb3+后(圖2(b))，材料顆粒尺寸主要分布在35～45 nm之間，且尺寸較為均勻。

圖2 UiO-66-(COOH)2(a)和Tb3+@UiO-66-(COOH)2(b)的TEM圖Fig.2 TEM images of UiO-66-(COOH)2 (a) and Tb3+@UiO-66-(COOH)2 (b)

2.2 Tb3+@UiO-66-(COOH)2的發(fā)光性能

圖3為Tb3+@UiO-66-(COOH)2固體粉末的發(fā)光性質圖。自然光下，UiO-66-(COOH)2和Tb3+@UiO-66-(COOH)2均為白色粉末，但在254 nm波長的紫外光照射下，Tb3+@UiO-66-(COOH)2表現(xiàn)為明亮的綠色熒光而前者無熒光發(fā)出。進一步利用熒光光譜儀測試固體粉末的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。之前的工作[31]表明UiO-66-(COOH)2的發(fā)射光譜為398 nm的寬峰，這一較弱的熒光信號源自配體的π→π*過渡[32]。經(jīng)負載Tb3+之后，材料的發(fā)射光譜發(fā)生了明顯的變化。在激發(fā)波長為322 nm下，共出現(xiàn)5個發(fā)射峰，其中400 nm處較弱的峰為有機配體(BTEC)的熒光峰；488,544,585,621 nm等4處的峰均分別為歸屬Tb3+的不同電子能級躍遷，即5d4→7f6,5d4→7f5,5d4→7f4,5d4→7f3躍遷，其中對應于最強發(fā)射峰(544 nm)的5d4→7f5躍遷是Tb3+的特征綠色熒光的主要原因。在發(fā)光機理方面，由配體向Tb3+的能量轉移為材料發(fā)光的主要原因。

圖3 固體材料Tb3+@UiO-66-(COOH)2的激發(fā)和發(fā)射波譜(插圖為自然光和254 nm紫外光照射下材料的發(fā)光性質)Fig.3 Excitation and emission spectra of solid material Tb3+@UiO-66-(COOH)2 (the illustration is the luminosity under natural light and 254 nm ultraviolet light)

2.3 Tb3+@UiO-66-(COOH)2對氨基酸的識別性能

為了研究Tb3+@UiO-66-(COOH)2對氨基酸的選擇性識別性能，樣品分散于含有不同氨基酸的HEPES溶液中，氨基酸的種類包括Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，Ile，Leu，Met，Pro，Ser，Thr，Val和Trp。如圖4所示，Tb3+@UiO-66-(COOH)2對不同氨基酸展現(xiàn)出了差異性的熒光響應，特別地，在Trp氨基酸溶液中，材料的熒光強度發(fā)生了明顯的削弱，而其他氨基酸溶液的熒光降低程度較小或無降低。插圖給出了樣品在空白和Trp環(huán)境下的熒光實像圖，可以看出，懸濁液的綠色熒光被明顯淬滅。在此基礎上，通過Stern-Volmer方程對氨基酸的淬滅效應進行定量分析：

圖4 322 nm激發(fā)波長下Tb3+@UiO-66-(COOH)2在不同氨基酸溶液的熒光光譜(插圖為材料在緩沖溶液和Trp溶液中的熒光實像圖)Fig.4 Fluorescence emission spectra of Tb3+@UiO-66-(COOH)2 under excitation wavelength of 322 nm in buffer solutions containing different amino acids (the illustrator is the real image of the material in blank solution and Trp solution)

I0/I=1+KsvC

(1)

式中：I0和I分別是材料在氨基酸溶液中浸泡前后的熒光強度;C為溶液中的氨基酸濃度，0.01 mol/L；Ksv為淬滅系數(shù),L/mol。經(jīng)計算，Trp的淬滅系數(shù)為417.8 L/mol，遠高于其他的氨基酸(平均為1.488 L/mol)。因此，該材料具有選擇性檢測Trp的潛力。

同時深入研究了不同濃度Trp氨基酸對Tb3+@UiO-66-(COOH)2的淬滅能力。圖5為不同情況下材料的熒光強度。如圖5(a)所示，隨Trp濃度的升高，樣品的熒光強度逐漸降低；當濃度低至10-5mol/L時，材料的淬滅程度仍可達到30%，顯示出材料對低濃度Trp響應的潛力。在濃度為10～100 μmol/L范圍內，材料的熒光強度和濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(圖5(b))，擬合得到的線性回歸方程為I=-0.00438C+3.1695，相關系數(shù)R為0.9902。通過式(2)計算材料對Trp的檢測限(limit of detection,LOD)：

圖5 不同情況下材料的熒光強度(a)濃度范圍為1×10-1～1×10-5 mol/L；(b)濃度范圍為1×10-4～1×10-5 mol/L(線性區(qū)域)；(c)時間范圍0.5～135 min；(d)二元氨基酸混合溶液Fig.5 Intensity of Tb3+@UiO-66-(COOH)2 under various conditions(a)concentration range of 1×10-1-1×10-5 mol/L;(b)concentration range of 1×10-4-1×10-5 mol/L(linear region);(c)time range of 0.5-135 min;(d)binary amino acids solutions

LOD=3S/k

(2)

式中：S為10次空白樣品熒光強度的標準偏差(0.00808);k為線性擬合方程的斜率(0.00438)。經(jīng)測定、計算得到LOD為5.53 μmol/L。與其他熒光探針尤其是MOF材料相比[9-13,23-25]，該材料具有相對較好的檢測限(表1)。BTAP5和1,8-pyrenedione雖然檢測限較低，然而其適用體系為水和有機溶劑的混合液，有機相的存在限制了其在生物體內檢測的應用。

表1 色氨酸探針的性能對比Table 1 Performance comparison of different Trp probes

進一步對Trp的熒光淬滅動力學進行了測試。如圖5(c)所示，快速的熒光淬滅發(fā)生在大約11 min，而最終的熒光強度則在35 min達到了平衡。最后，考慮到實際環(huán)境中，Trp氨基酸常和其他氨基酸共存，因此有必要調查在多元組分中的熒光響應能力。圖5(d)統(tǒng)計了波長在544 nm處12種其他氨基酸溶液的熒光強度，當向每份溶液中加入等量的Trp時，懸濁液的熒光強度均發(fā)生了顯著的下降，且與Trp單組分體系的熒光強度較為接近。進一步反映材料具有良好選擇性的同時，也體現(xiàn)了材料較好的抗干擾能力。

羧基和Tb3+的配位可能會受到pH值的影響，從而進一步影響材料對Trp氨基酸的檢測性能。因此，為了優(yōu)化檢測條件，進一步研究了材料在不同pH值下的熒光檢測性能。圖6為不同pH值對于Tb3+@UiO-66-(COOH)2熒光檢測Trp的影響，如圖6所示，在不含Trp氨基酸的體系中，強酸溶液(pH值為2)破壞了羧基和Tb3+的結合，使材料自身發(fā)光強度明顯降低。在pH值為4，6.4，8，10的水溶液中，材料的發(fā)光強度同上述緩沖液中的熒光強度類似，淬滅幅度也相似。因此，該材料可在較寬的pH值范圍(4～10)內實現(xiàn)Trp的檢測。

圖6 不同pH值對于Tb3+@UiO-66-(COOH)2熒光檢測Trp的影響Fig.6 Intensity of Tb3+@UiO-66-(COOH)2 for detecting Trp under different pH values

2.4 檢測機理

以上結果表明，Tb3+@UiO-66-(COOH)2能夠選擇性檢測色氨酸。目前，基于鑭系MOF的Trp熒光探針報道較少，檢測機理仍需進一步完善。通常，待檢測分子的紫外吸收光譜和熒光材料的發(fā)射或激發(fā)光譜的重疊會嚴重削弱材料的發(fā)光強度，這是由于被檢測分子和熒光材料對紫外光的競爭或者發(fā)射光能量向被檢測客體小分子轉移。因此從光譜重合的角度對淬滅機理進行了探索。圖7為13種氨基酸溶液的紫外光譜圖。由于材料的發(fā)射光譜遠遠偏離氨基酸的紫外吸收峰，因此本工作重點比對了材料的激發(fā)光譜和所測氨基酸的紫外吸收峰。

圖7 不同氨基酸緩沖液的紫外吸收光譜和材料的激發(fā)光譜圖(除Trp外，其他氨基酸的濃度均為0.01 mol/L)Fig.7 Ultraviolet absorption spectra of different amino acids HEPES solutions and fluorescence emission spectra of the material (the concentrations of all the amino acids solutions are 0.01 mol/L except Trp solution)

如圖7所示，大部分氨基酸溶液(0.01 mol/L)的紫外吸收峰多集中在200～250 nm之間；Cys的吸收峰較寬，延伸至300 nm左右；而同等濃度下的色氨酸雙吸收峰無法區(qū)分開來，因此進一步測定了其在0.001 mol/L濃度下的譜圖，可以看出色氨酸的兩個吸收峰分別位于227 nm和279 nm處。從圖7可以明顯看出，色氨酸的紫外吸收譜與Tb3+@UiO-66-(COOH)2的激發(fā)光譜有很大的重合區(qū)域，意味著熒光材料和色氨酸同時對紫外光產生了強烈的競爭作用，導致Tb3+@UiO-66-(COOH)2的熒光在色氨酸溶液中發(fā)生淬滅；同時，由于半胱氨酸和材料的激發(fā)光譜也存在少量的重合區(qū)域，因此材料在Cys中的強度也有小幅的削弱；其他氨基酸的吸收峰和材料的激發(fā)峰幾乎沒有重合，故很難對樣品的熒光產生大的淬滅作用。

3 結論

(1)通過后合成修飾法成功制備了新型熒光材料Tb3+@UiO-66-(COOH)2，材料中有機配體向Tb3+的能量轉移使其在紫外燈照射下顯示為綠色熒光。

(2)在常見的多種氨基酸中，色氨酸能夠靈敏地、選擇性地淬滅材料的綠色熒光，檢測限為5.53 μmol/L。

(3)Tb3+@UiO-66-(COOH)2用于識別色氨酸，其動力學結果表明35 min熒光淬滅達到了平衡，同時該材料還具有良好的抵抗其他氨基酸和溶液pH值干擾的能力。

(4)檢測機理為材料的熒光激發(fā)光譜和色氨酸的紫外吸收譜存在較大重合，二者對紫外光信號的競爭作用導致了熒光的淬滅。