圓二色和拉曼光譜法分析Ⅰ型膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及熱變性

程 紅， 王 玲

（華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心，武漢 430074）

0 引 言

Ⅰ型膠原蛋白是皮膚、肌腱、骨骼和其他結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)成分，在生物醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，膠原蛋白已被用于止血海綿、真皮等效物、軟組織增強(qiáng)注射材料、細(xì)胞制品基質(zhì)和藥物輸送載體［1］。此外，膠原蛋白涉及許多病理學(xué)，其中成骨不全癥、先天性結(jié)締組織發(fā)育不全綜合征和纖維化是最嚴(yán)重的。在所有這些疾病中，膠原蛋白構(gòu)象的變化從展開(kāi)到最終形成和纖顫是主要問(wèn)題［2］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象可為理解其功能提供重要線(xiàn)索［3］。

研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用實(shí)驗(yàn)方法是X-射線(xiàn)衍射和核磁共振波譜。這些技術(shù)的數(shù)據(jù)需要通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)換成原子結(jié)構(gòu)，但如果蛋白質(zhì)很難分離或結(jié)晶，則實(shí)驗(yàn)常常需要在電子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中得到補(bǔ)充［4］。通常α-螺旋、β-折疊和非周期構(gòu)象中的肽鍵部分可以通過(guò)高靈敏度的光學(xué)測(cè)量來(lái)估計(jì)，例如圓二色（CD）、紅外（IR）和拉曼（Raman）光譜［5-7］。使用光譜測(cè)量來(lái)分析二級(jí)結(jié)構(gòu)，是評(píng)估蛋白質(zhì)聚集性和穩(wěn)定性的一個(gè)有價(jià)值的工具。對(duì)于分子生物學(xué)中的許多重要問(wèn)題，如蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-核酸相互作用，二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量測(cè)量提供了生物功能結(jié)構(gòu)特征的重要線(xiàn)索［3］。光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是測(cè)試非常迅速，所需材料很少，而且可以很方便地考察溫度變化帶來(lái)的影響。CD是一種古老的光譜技術(shù)，在球形蛋白中研究的比較透徹，但在纖維狀的膠原蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一些特殊的特征，如PPII（P2）結(jié)構(gòu)，還需要更全面地理解。IR和Raman同屬于分子振動(dòng)光譜，兩者相比，后者不易受水峰干擾，可以更容易地檢測(cè)出，主要反映在脂質(zhì)、酰胺、脯氨酸和羥基脯氨酸區(qū)的任何構(gòu)象變化［5］，因此更適合膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)研究［8］。本文采用CD和Raman兩種光譜技術(shù)分別對(duì)同一種Ⅰ型膠原蛋白的溶液態(tài)和固態(tài)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，并觀察隨溫度變化，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生的改變（即熱變性），旨在為膠原蛋白相關(guān)研究提供二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的實(shí)驗(yàn)參考和技術(shù)支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器及試劑

日本Jasco公司J-810型圓二色光譜儀（配有Julabo F12水浴變溫裝置）；Horiba Jobin Yvon公司HR-800型激光共焦拉曼光譜儀（配有Linkam 600型冷熱臺(tái)）。所有試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18 MΩ·cm）。

1.2 樣 品

固態(tài)Ⅰ型膠原蛋白：由武漢某生物材料有限公司提供的膠原蛋白海綿，批號(hào)：YF19070001，使用前未做任何處理。

溶液態(tài)Ⅰ型膠原蛋白：準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的固態(tài)膠原蛋白溶于0.01 mol／L乙酸水溶液，配置成濃度為0.1 mg／ml的溶液，于4℃冰箱中放置2 d，使肽段充分折疊。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果分析

2.1 圓二色光譜分析

2.1.1 分析原理

基于對(duì)CD光譜的經(jīng)驗(yàn)分析，有許多解卷積算法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。這些方法都是利用已知晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的CD譜數(shù)據(jù)集的信息，從CD譜中計(jì)算出感興趣的蛋白質(zhì)（查詢(xún)蛋白）的結(jié)構(gòu)。它們基于這樣的假設(shè)：參考蛋白質(zhì)（reference proteins）的結(jié)構(gòu)在晶體狀態(tài)和溶液中相同，并且單個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)CD光譜的貢獻(xiàn)是相加的，如下式［9］：

式中：Cλ指蛋白質(zhì)的CD光譜，為波長(zhǎng)的函數(shù)；fi是給定類(lèi)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分?jǐn)?shù)；Biλ是每種二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型（螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、無(wú)序等）在每個(gè)波長(zhǎng)下的橢圓度；noise項(xiàng)中包括芳香族側(cè)鏈的貢獻(xiàn)。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，有一些算法的軟件語(yǔ)言已經(jīng)變得晦澀難懂，現(xiàn)在仍然可以下載或在線(xiàn)使用的算法包括SELCON3和CDSSTR，它們是基于奇異值分解（Singular Value Decomposition，SVD）方法和變量選擇方法的算法，CONTINLL是使用脊回歸和變量選擇的修改版本，以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。所有這些算法都對(duì)光譜的大小敏感，因此精確的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析取決于有良好的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)、光譜中的寬波長(zhǎng)覆蓋，以及具有與查詢(xún)蛋白類(lèi)似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的參考數(shù)據(jù)集［9］。

2.1.2 儀器的校準(zhǔn)

單色儀的失調(diào)會(huì)使波長(zhǎng)產(chǎn)生微小的偏移，表現(xiàn)為CD峰位的偏移，并對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析產(chǎn)生重大影響。本文使用有證書(shū)的氧化鈥玻璃對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)。

此外，使用6 mg／mL的d-10-樟腦磺酸銨溶液對(duì)光譜強(qiáng)度進(jìn)行校準(zhǔn)，保證圓二色光譜儀處于良好的工作狀態(tài)。

2.1.3 光譜的采集

CD測(cè)量是在相對(duì)稀釋的蛋白質(zhì)溶液（0.01～0.2 mg／mL）上進(jìn)行，樣品在感興趣波長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大吸光度不得超過(guò)2［3］。稀溶液的優(yōu)點(diǎn)是使樣品的濃度依賴(lài)性聚集最小化。本次實(shí)驗(yàn)溶液樣品濃度為0.1 mg／mL，使用同一個(gè)池長(zhǎng)為0.1 cm的石英比色皿（Type：31／B／Q／1，Starna Scientific Ltd.Hainault，Essex IG6 3UT，United Kingdom）分別裝載背景溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)試。

為了防止光譜變形，儀器參數(shù)的設(shè)置也有推薦的經(jīng)驗(yàn)選擇［9］，掃描速度×響應(yīng)時(shí)間＜帶寬＜光譜特征寬度／10。如要解析特征寬度為10 nm的光譜，需要小于1 nm的帶寬；如果使用1 s響應(yīng)時(shí)間，則掃描速度不應(yīng)超過(guò)10 nm／min。

本文采用的測(cè)試參數(shù)為：掃描速度100 nm／min，響應(yīng)時(shí)間0.5 s，帶寬1 nm，累積次數(shù)3次。分別采集20、30、40、50、60、70℃下的樣品溶液CD光譜圖。得到的譜圖經(jīng)過(guò)扣除背景、平滑處理后見(jiàn)圖1。

2.1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖1 不同溫度下膠原溶液的圓二色光譜圖

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由一組二面角（φ，ψ）決定的，它定義了肽主鏈的空間方向，以及特殊氫鍵的存在。當(dāng)主鏈二面角有重復(fù)值時(shí)，肽形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)［3］。膠原蛋白結(jié)構(gòu)為3條平行的多肽鏈，以左旋、聚脯氨酸II型（P2）螺旋構(gòu)象相互纏繞，1個(gè)殘基交錯(cuò)形成右手三螺旋［10］。三螺旋結(jié)構(gòu)中緊緊包裹著P2螺旋的要求每隔2個(gè)殘基就出現(xiàn)1個(gè)Gly，這導(dǎo)致了1個(gè)重復(fù)的XaaYaaGly序列，其中膠原的Xaa和Yaa位置的氨基酸通常分別為（2S）-脯氨酸（Pro，28%）和（2S，4R）-4-羥脯氨酸（Hyp，38%）［10］。因此，膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中除了局部相鄰氨基酸發(fā)生盤(pán)曲而形成螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)以外，還有一個(gè)特殊的PPII（P2）螺旋結(jié)構(gòu)。計(jì)算時(shí)會(huì)有一些特殊的要求，比如，按照文獻(xiàn)［11］中介紹的在線(xiàn)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的網(wǎng)站，本文選用DichroWeb（http：／／dichroweb.cryst.bbk.ac.uk／html／home.shtml）網(wǎng)站在線(xiàn)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)，將采集到的光譜數(shù)據(jù)輸入網(wǎng)址進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，網(wǎng)站要求reference的設(shè)置只能是set5，并且數(shù)據(jù)的掃描范圍為178～260 nm。選用CONTIN解卷積算法，按照要求輸入后計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下膠原溶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算結(jié)果

從表1的數(shù)據(jù)結(jié)合圖1可以看出，在溫度低于40℃時(shí)，P2結(jié)構(gòu)隨溫度升高而降低，說(shuō)明溫度使膠原蛋白的三螺旋發(fā)生解旋，P2結(jié)構(gòu)被逐步破壞；而當(dāng)溫度大于40℃后，α-螺旋結(jié)構(gòu)隨溫度升高逐漸增加，這種構(gòu)象的轉(zhuǎn)變引起膠原功能的改變，造成膠原的變性［13］。

2.2 拉曼光譜分析

2.2.1 分析原理

拉曼光譜定義為入射光和散射光頻率之間的差異，該頻率差與鍵的類(lèi)型及其振動(dòng)類(lèi)型有關(guān)。特征原子群會(huì)產(chǎn)生頻率接近相同的振動(dòng)帶，而與它們所在的分子無(wú)關(guān)。在該范圍內(nèi)的精確波數(shù)取決于分子間和分子內(nèi)的影響，包括肽鍵角度和氫鍵模式。拉曼光譜中酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶通常被用來(lái)歸屬蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，參考具有α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)的同型多肽和蛋白質(zhì)的光譜、理論計(jì)算（正態(tài)模式分析）、合成肽和具有已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)來(lái)確定特定頻率與二級(jí)結(jié)構(gòu)［3］。通過(guò)酰胺帶相關(guān)拉曼光譜指標(biāo)的變化，可以觀察到從膠原的有序結(jié)構(gòu)（即三螺旋結(jié)構(gòu)）到由于內(nèi)部（如老化和疾?。┗蛲獠浚ㄈ鐭嶙冃院蜋C(jī)械變性）影響而導(dǎo)致向較不有序的結(jié)構(gòu)形式的轉(zhuǎn)變［7］。

2.2.2 儀器校準(zhǔn)

由于每天的溫度和濕度會(huì)有差別，導(dǎo)致峰位會(huì)有些差異，因此最好能在使用儀器前對(duì)峰位進(jìn)行校正。峰位校正以單晶硅的一階峰（520.7 cm－1）作為參考峰位進(jìn)行。校正前，確保用于校正的激光器已打開(kāi)，并且最少預(yù)熱10 min，使激光器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 光譜采集

在拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中，為了獲得最佳的拉曼信號(hào)，需要考慮每種激光波長(zhǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)。散射的光子數(shù)與激光波長(zhǎng)間接相關(guān)，拉曼線(xiàn)的強(qiáng)度與激光頻率的4次方成正比［14］：

式中：l為拉曼線(xiàn)的強(qiáng)度；ν為激光源的頻率。因此，當(dāng)比較532 nm激光器和785 nm激光器時(shí)，

式中：c為光速；λ為激光源的波長(zhǎng)。

可以看出，非共振條件下，532 nm激光產(chǎn)生的拉曼譜線(xiàn)強(qiáng)度比785 nm激光器產(chǎn)生的拉曼線(xiàn)強(qiáng)度強(qiáng)4.7倍。但是在樣品有較強(qiáng)熒光干擾時(shí)，可以使用長(zhǎng)波長(zhǎng)的激光器如785 nm激光器和1 064 nm激光器來(lái)減少干擾。

本文采用生物樣本中常用的Nd-YAG：532 nm激光源，光柵600 gr／mm，×50LWD物鏡，200μm針孔，60 s曝光時(shí)間，將樣品置于Linkam變溫臺(tái)的比色皿中采集不同溫度下的光譜數(shù)據(jù)，得到的譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

拉曼光譜中，酰胺I和酰胺III帶的頻率可以檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，該區(qū)域與碳?xì)渖炜s振動(dòng)區(qū)（即脂質(zhì)區(qū)，lipids）、脯氨酸和羥脯氨酸區(qū)一起是膠原結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的3個(gè)主要區(qū)域［5］，如圖3所示（圖示為溫度20℃時(shí)固態(tài)膠原蛋白的拉曼光譜圖），正是這些二級(jí)結(jié)構(gòu)為膠原蛋白提供穩(wěn)定性和纖維狀結(jié)構(gòu)。酰胺I帶從1 700～1 600 cm－1，是肽鏈振動(dòng)，主要來(lái)源于C＝O伸縮振動(dòng)（～80%）和C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)（～20%）。它產(chǎn)生一個(gè)非常強(qiáng)烈的信號(hào)，并且對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)敏感；酰胺III帶（～1 310～1 175 cm－1）主要與C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)（各約30%）、C—C伸縮（～20%）和C—H彎曲（～10%）有關(guān)［6］。盡管它的強(qiáng)度很低，大約比酰胺Ⅰ降低80%，但它對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也非常敏感，而且不受吸水率的影響［6］。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)，將指紋區(qū)峰值進(jìn)行歸屬，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表2。

圖2 固態(tài)膠原蛋白的變溫拉曼光譜圖

圖3 反映構(gòu)象變化的主峰所在3個(gè)主要光譜區(qū)域

表2 固態(tài)膠原蛋白的拉曼光譜指紋區(qū)的主要譜峰歸屬及其與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系

結(jié)合圖2和表2可以看出，蛋白質(zhì)主鏈的C—C伸縮振動(dòng)峰936 cm－1譜峰的強(qiáng)度隨著溫度升高而降低，至200℃時(shí)完全消失，這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子和原子之間的距離也會(huì)增加，從而削弱氫鍵和范德華力，導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)的破壞［13］。根據(jù)反應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)中有序和無(wú)序結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)譜峰的比例關(guān)系，可以判斷膠原蛋白的變性與否，比如I1 670／1 640，I1 245／1 270，I1 245／1 454，其中I1 245／1 454逐漸減小，I1 670／1 640，I1 245／1 270逐漸升高，這些峰值強(qiáng)度比可以作為新的光譜生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估膠原蛋白的質(zhì)量和完整性［16-17］。變性過(guò)程中這些比值的變化可能反映出膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，特別是從有序結(jié)構(gòu)到低有序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變［17］。根據(jù)圖2的數(shù)據(jù)，以最高峰的峰高為基峰進(jìn)行歸一化處理，得到這些光譜生物標(biāo)志物隨溫度變化的值，列于表3。

表3 本次實(shí)驗(yàn)中拉曼光譜生物標(biāo)志物的強(qiáng)度比

從表3可以看出，固態(tài)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)在200℃以?xún)?nèi)保持穩(wěn)定，超過(guò)200℃后發(fā)生變性。肉眼可見(jiàn)白色的膠原蛋白海綿在200℃變性溫度下開(kāi)始發(fā)黃。該結(jié)果與差熱分析（DSC，測(cè)試條件：在氮?dú)鈿夥障?，?℃／min的升溫速率從30℃升至250℃，所得譜圖見(jiàn)圖4，在80℃和220℃左右有吸收峰，第1個(gè)峰面積和寬度較大，是膠原蛋白海綿失水放熱峰；第2個(gè)峰面積較小，是膠原蛋白海綿在熱收縮過(guò)程中結(jié)構(gòu)破壞所對(duì)應(yīng)的晶區(qū)熔融峰）對(duì)應(yīng)發(fā)生熱變性的溫度范圍的結(jié)果基本吻合，說(shuō)明使用拉曼光譜生物標(biāo)志物來(lái)判斷變性是科學(xué)可行的。

圖4 固體膠原蛋白的DSC圖

3 結(jié) 語(yǔ)

CD是一種廣泛應(yīng)用的分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的光譜技術(shù)，該技術(shù)可用于區(qū)分無(wú)序和有序結(jié)構(gòu)。在球形蛋白，如牛血清白蛋白、溶菌酶和α-糜蛋白酶等蛋白中研究的比較透徹，而在纖維狀的膠原蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一些特殊的特征，還需要更全面的理解。Raman光譜分析膠原蛋白可以提供很多信息，并且隨著理解的加深，它可以識(shí)別由于疾病或老化過(guò)程而導(dǎo)致膠原蛋白變化的化學(xué)途徑，人們將了解到膠原是如何隨著年齡、疾病和創(chuàng)傷而改變的。目前，拉曼光譜的潛力還沒(méi)有被完全挖掘，雖然數(shù)據(jù)采集速度很快，但數(shù)據(jù)分析需要相當(dāng)?shù)募寄芎蜁r(shí)間。因此，基于這兩種光譜技術(shù)，本文對(duì)溶液態(tài)和固態(tài)的Ⅰ型膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，詳細(xì)敘述了實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)過(guò)程，考察溫度對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，該工作可作為膠原蛋白相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)引導(dǎo)和示范。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ型膠原蛋白溶液態(tài)的變性溫度約為40℃，固態(tài)（又稱(chēng)膠原蛋白海綿）的變性溫度約為200℃，固態(tài)比液態(tài)穩(wěn)定，尤其是在室溫范圍內(nèi)不會(huì)變性，這有利于其在臨床上的推廣應(yīng)用。