經(jīng)皮穴位電刺激對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠外周阿片肽表達水平的影響

劉天紅,宋召軍,裘晟晨

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院,義烏 322000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的自身免疫性疾病[1],以糜爛性、反復(fù)遷延性、對稱性的多個小關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鱗2],臨床表現(xiàn)為慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)組織破壞和功能受損[3-4]。RA所致的進行性關(guān)節(jié)損傷和功能性殘疾嚴重影響患者的身心健康以及生活[5-6]。RA臨床治療,主要采用消炎鎮(zhèn)痛、免疫抑制劑和激素治療為主,這些治療方法會導(dǎo)致多種不良反應(yīng)和毒副作用。

經(jīng)皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupointstimulation, TEAS)是以針灸經(jīng)絡(luò)學(xué)理論為依據(jù),在皮膚特定穴位貼敷電極片,以不同頻率和強度的脈沖電流作用于人體治療的技術(shù),是中醫(yī)針灸學(xué)與經(jīng)皮神經(jīng)電刺激(transcutaneous electricalnerve stimulation, TENS)相輔相成的新型療法,在緩解急慢性疼痛、改善患者生活質(zhì)量等方面療效顯著[7-8]。TEAS抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)非常明確,但機理研究主要局限于對致炎性細胞因子等炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)上[9-10]。已有大量研究證明TEAS能有效促進RA模型大鼠內(nèi)源性阿片肽(endogenous opioid peptide, EOP)的釋放而達到中樞鎮(zhèn)痛作用,也有初步研究顯示TEAS同樣能通過刺激外周阿片肽(peripheral opioid peptide, POP)及其受體的釋放與激活而干預(yù)外周疼痛[11-12],但 TEAS是否作為一種有效刺激,激活外周炎癥局部阿片系統(tǒng),產(chǎn)生對RA炎癥疼痛的綜合調(diào)節(jié),仍缺少足夠的研究。

本文旨在從外周神經(jīng)免疫途徑研究 TEAS治療對RA大鼠炎癥疼痛的抑制效應(yīng)、對外周和炎癥局部阿片肽釋放和受體的激活及致炎性細胞因子的調(diào)控情況,闡明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛(及其他類似慢性疼痛)的TEAS治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級健康雄性Wistar大鼠60只,體質(zhì)量(180±10)g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心[SCXK(滬)2017-0005],由浙江大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)(由實驗動物中心提供)和自由飲水,12 h循環(huán)照明。動物實驗經(jīng)浙江大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),動物的操作遵照國內(nèi)外相關(guān)倫理要求執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器

動物用七氟烷氣體麻醉劑(R511-22,深圳瑞沃德公司),TRIZOL(15596026,美國 Invitrogen公司),裂解液(P0013C,江蘇碧云天公司),蛋白酶抑制劑(E429,美國Amresco公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,寶生物工程公司),Ssofast Eva Green Super Mix(1725202,美國 Bio-RAD公司),弗氏完全佐劑 CFA(F5581,美國Sigma 公司),IL-1β、IL-6、TNF-α和前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)ELISA試劑盒(20191210,北京華英生物技術(shù)研究所),β內(nèi)啡肽標(biāo)準(zhǔn)品(77367-63-6,英國Abcam公司),甲硫氨酸腦啡肽標(biāo)準(zhǔn)品(58569-55-4,英國 Abcam公司),強啡肽 A標(biāo)準(zhǔn)品(80448-90-4,英國 Abcam公司)。小動物氣體麻醉機(R500,深圳瑞沃德公司),韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀(Hans-200E,北京華衛(wèi)公司),超聲波細胞粉碎機(Scientz-950E,寧波新芝生物公司),足底測量儀(37450,意大利 UgoBasile公司),足腫容積測量儀(PV-200,成都泰盟公司),酶標(biāo)儀(Cytation1,美國Bio-RAD公司),核酸蛋白分析儀(SmartSpec 3000,美國 Bio-RAD公司),熒光定量 PCR儀(CFX96,美國Bio-RAD公司),高效液相色譜儀(A46008,德國Knauer公司),HPLC色譜柱(25EE181ESJ,德國Knauer公司),紫外檢測器(ADB01,德國Knauer公司)。

1.3 造模方法與分組

將實驗大鼠隨機分為 3組,分別為空白對照組(Normal)、模型對照組(CFA)、經(jīng)皮穴位電刺激治療組(TEAS),每組20只。CFA組和TEAS組均于右后足足底內(nèi)注射CFA(2.5 mg/mL,每只注射0.1 mL,僅注射1次),建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛模型[13-14]。Normal組注射等劑量生理鹽水。TEAS組大鼠雙后肢脫毛后,自然下垂固定,參照華興邦大鼠穴位圖譜[15],取患側(cè)后肢足三里、昆侖穴,用直徑為5 mm的圓形鉑金電極,貼敷固定,使電極與皮膚保持良好接觸,電極連接韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀,疏密波刺激 2/100 Hz,強度 1～2 mA(15 min后增加1 mA),共30 min。造模24 h后開始經(jīng)皮穴位電刺激治療,每日1次,共治療20次。CFA組僅貼敷固定鉑金電極,不予通電。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 足跖熱縮腿閾測定

采用動態(tài)足底測量儀檢測大鼠患足跖熱縮腿閾(thermal paw withdrawal latency, PWL)作為大鼠熱痛閾指標(biāo)。測量前先將大鼠置于透明塑料盒中,待大鼠安靜后,將聚焦的紅外熱源置于大鼠右后足中央,避開足墊,對足底進行熱刺激,刺激時間上限 20 s,最大熱輻射強度為 30,儀器自動記錄大鼠縮足反應(yīng)時的潛伏期和紅外輻射強度。連續(xù)測量3次,每次間隔10 min。分別于造模前和造模后1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d檢測Normal組、CFA組和TEAS組實驗大鼠右后足熱縮腿閾變化情況。

1.4.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)[16]

采用WOOD氏關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)各大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度及累及關(guān)節(jié)數(shù),計分比較。0分為正常;1分為輕微紅腫,累及一個趾關(guān)節(jié);2分為輕度紅腫,累及2個及以上趾關(guān)節(jié);3分為嚴重紅腫,累及整個足跖;4分為重度紅腫,整個足跖缺乏彈性。分別于造模前和造模后1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d檢測Normal組、CFA組和TEAS組實驗大鼠右后足關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化情況。

1.4.3 足跖腫脹度測定[17]

大鼠足跖腫脹度采用足腫容積測量儀測定。以大鼠足跖毛際為標(biāo)記線,分別于造模前和造模后1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d檢測Normal組、CFA組和TEAS組實驗大鼠右后足跖容積變化情況。足腫脹度(mL)＝腫脹后各時間點足容積(mL)－腫脹前足容積(mL)。

1.4.4 足跖組織中炎性因子測定

采用 ELISA法檢測足跖組織中白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)含量。采用七氟烷麻醉大鼠后開胸暴露心臟,使用 4℃生理鹽水經(jīng)升主動脈快速灌注,迅速將大鼠患側(cè)足爪剪下,去皮,液氮中研碎,按1 mg組織加100 μL裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑比例加入配好的裂解液,冰浴中超聲粉碎,高速低溫離心后,取上清。按照試劑盒說明書檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2表達水平。

1.4.5 足跖組織中阿片肽測定

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測足跖組織中β內(nèi)啡肽(β-endorphin, β-EP)、甲硫氨酸腦啡肽(methionine enkephalin, met-ENK)和強啡肽A(dynorphin A, DYN-A)含量。采用七氟烷麻醉大鼠后開胸暴露心臟,使用 4℃生理鹽水經(jīng)升主動脈快速灌注,迅速將大鼠患側(cè)足爪剪下,去皮后在液氮中研碎,按1 mg組織加100 μL裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑比例加入裂解液,冰浴中超聲粉碎,高速低溫離心后,取上清0.45 μm濾膜過濾。取續(xù)濾液20 μL進行HPLC測定。高效液相色譜條件為KNAUER C18色譜柱;流動相為 0～4 min乙腈(100mM)-KH2PO4,4～6 min乙腈(100mM)-水,6～12 min乙腈(100mM)-KH2PO4,流速1.0 mL/min;檢測波長 210 nm;柱溫為 40 ℃,進樣20 μL。各雜峰與主峰分離度應(yīng)大于1.5,且具有一定的主峰理塔板數(shù)。

1.4.6 足跖組織中阿片肽前體mRNA測定

采用熒光定量PCR法檢測足跖組織中阿黑皮素原(proopiomelanocortin, POMC)、前腦啡肽原(proenkephalin, PENK)和前強啡肽原(prodynorphin,PDYN)阿片肽前體mRNA含量。采用七氟烷麻醉大鼠后開胸暴露心臟,使用 4 ℃生理鹽水經(jīng)升主動脈快速灌注,迅速將大鼠患側(cè)足爪剪下,去皮,液氮中研為粉末(約100 mg),加入1 mL Trizol溶液,按試劑盒說明書操作步驟進行總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL。以上各標(biāo)本均做3個復(fù)孔。擴增條件為 95 ℃預(yù)變性 30 min,95 ℃變性10 s,61.9 ℃退火/延伸30 s,共40個循環(huán),每個循環(huán)退火/延伸末期檢測熒光信號?；虮磉_分析采用 2﹣△△CT法,差異≥2倍,認為基因表達增高,若≤0.5倍,認為基因表達降低[18]。各檢測指標(biāo)引物詳見表1。

表1 內(nèi)參和各目的基因的引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分數(shù)和例數(shù)表示,比較采用卡方檢驗;符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用t檢驗;重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠PWL的比較

造模前,3組大鼠PWL無明顯差異(P＞0.05)。CFA組和 TEAS組大鼠足趾注射 CFA24h后,PWL顯著低于Normal組(P＜0.01),表明成功建立大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛模型。20 d內(nèi),CFA組大鼠各時間點PWL顯著低于 Normal組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。TEAS組大鼠各時間點 PWL明顯延長,20 d后 PWL顯著高于CFA組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),與Normal組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。詳見表2、圖1。

表2 3組大鼠PWL的比較 (±s,s)

表2 3組大鼠PWL的比較 (±s,s)

注:與Normal組比較1)P＜0.01;與CFA組比較2)P＜0.01

組別 n 0 d 1 d 4 d 8 d 12 d 16 d 20 d Normal組 20 11.51±0.29 11.90±0.59 11.60±0.34 11.75±0.47 12.09±0.50 11.95±0.55 12.01±0.31 TEAS 組 20 11.52±0.29 4.87±0.481) 6.33±0.44 7.00±0.50 8.43±0.47 9.80±0.47 10.33±0.572)CFA 組 20 11.42±0.30 4.73±0.471) 4.55±0.351) 5.28±0.441) 5.74±0.411) 5.59±0.291) 5.71±0.261)

圖1 TEAS治療對CFA大鼠熱痛閾的影響

2.2 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較

造模前,3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均為 0分。CFA組和TEAS組大鼠足趾注射CFA 24h后,關(guān)節(jié)炎指數(shù)均達到4分,表明造模成功。20 d內(nèi),CFA組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)緩慢降低至3分;TEAS組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)較快速降低至1分,且低于CFA組(P＜0.05)。詳見表3、圖2。

表3 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較 (±s,分)

表3 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較 (±s,分)

注:與CFA組比較1)P＜0.05

組別 n 0 d 1 d 4 d 8 d 12 d 16 d 20 d Normal 組 20 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 TEAS 組 20 0.00±0.00 4.00±0.00 2.80±0.42 2.10±0.32 1.20±0.42 0.80±0.42 0.70±0.481)CFA 組 20 0.00±0.00 4.00±0.00 3.90±0.32 3.30±0.48 3.20±0.42 2.90±0.32 2.30±0.48

圖2 3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較

2.3 3組大鼠足跖腫脹度的比較

造模前,Normal組、CFA組和TEAS組大鼠足跖大小無明顯差異(P＞0.05)。大鼠足趾注射 CFA 24 h后,CFA組(8.12 mL)和TEAS組(8.16 mL)大鼠足跖腫脹度無明顯差異(P＞0.05),表明成功建立大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛模型。治療20 d,TEAS組大鼠足跖腫脹度顯著低于CFA組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表4、圖3。

表4 3組大鼠足跖腫脹度的比較 (±s, mL)

表4 3組大鼠足跖腫脹度的比較 (±s, mL)

注:與CFA組比較1)P＜0.01

組別 n 0 d 1 d 4 d 8 d 12 d 16 d 20 d Normal 組 20 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 TEAS 組 20 0.00±0.00 8.11±0.59 5.54±0.51 3.97±0.58 2.26±0.59 0.97±0.47 0.56±0.291)CFA 組 20 0.00±0.00 8.12±0.58 7.54±0.61 7.04±0.55 5.93±0.62 6.35±0.42 5.16±0.40

圖3 3組大鼠足跖腫脹度的比較

2.4 3組大鼠炎性因子表達水平的比較

治療20 d后,與Normal組比較,CFA組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和 PGE2免疫炎性因子表達水平升高(P＜0.05);與Normal組比較,TEAS組大鼠IL-1β和PGE2表達水平升高(P＜0.05);與 CFA組比較,TEAS組大鼠IL-6和TNF-α表達水平降低(P＜0.05)。詳見表5。

表5 3組大鼠炎性因子表達水平的比較 (±s, pg/mg)

表5 3組大鼠炎性因子表達水平的比較 (±s, pg/mg)

注:與Normal組比較1)P＜0.05;與CFA組比較2)P＜0.05

組別 n IL-1β IL-6 TNF-α PGE2 Normal 組 20 6.89±1.91 16.32±6.46 5.89±1.42 15.33±1.49 TEAS 組 20 33.89±1.821) 23.74±4.322) 13.93±1.802) 33.44±1.851)2)CFA 組 20 27.35±5.601) 57.21±2.421) 32.64±2.991) 31.18±5.321)

2.5 3組大鼠阿片肽表達水平的比較

線性關(guān)系試驗結(jié)果顯示,β-EP、met-ENK和DYN-A分別在 0.1 pg/μL～1.0 pg/μL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗結(jié)果顯示,β-EP、met-ENK和DYN-A連續(xù)進樣6次的RSD值分別為 0.35%、0.41%和 0.32%。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示,β-EP、met-ENK和DYN-A在處理后12h內(nèi)的RSD值分別為0.55%、0.63%和0.62%。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示,6份β-EP、met-ENK和DYN-A測試的RSD值分別為1.15%、1.09%和 9.87%。回收率試驗結(jié)果顯示,9份β-EP、met-ENK和DYN-A測試的RSD值分別為0.95%、0.89%和9.13%。治療20 d后,CFA組大鼠β-EP、met-ENK和DYN-A顯著高于Normal組(P＜0.05),表明慢性炎癥疼痛能部分激活外周阿片系統(tǒng),提示可能在炎癥疼痛時存在內(nèi)源性的阿片肽介導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用。TEAS組大鼠β-EP表達水平顯著高于 CFA組和 Normal組(P＜0.05),met-ENK表達水平與CFA組和Normal組沒有明顯差異(P＞0.05),DYN-A表達水平與CFA組和Normal組沒有明顯差異(P＞0.05),表明 TEAS治療對外周阿片系統(tǒng)的激活是有選擇性的,其鎮(zhèn)痛作用可能與外周β-EP水平的上調(diào)表達有關(guān)。詳見表6。

表6 3組大鼠阿片肽表達水平的比較 (±s, pg/mg)

表6 3組大鼠阿片肽表達水平的比較 (±s, pg/mg)

注:與Normal組比較1)P＜0.05;與CFA組比較2)P＜0.05

組別 n β-EP met-ENK DYN-A Normal組 20 0.25±0.05 0.19±0.03 0.14±0.02 TEAS 組 20 0.66±0.031)2) 0.37±0.031) 0.27±0.051)CFA 組 20 0.40±0.041) 0.29±0.061) 0.27±0.041)

2.6 3組大鼠阿片肽前體mRNA表達的比較

結(jié)果顯示POMC、PENK mRNA在足跖炎癥組織均有表達,PDYN基因在足跖炎癥組織沒有表達,可能存在其他調(diào)控方法。與Normal組比較,TEAS能顯著上調(diào)足跖炎癥組織中β-EP前體POMC基因表達水平(2.18倍),但對 met-ENK前體 PENK無顯著影響(0.63倍),表明TEAS鎮(zhèn)痛可能與外周內(nèi)啡肽表達相關(guān)。詳見表7。

表7 3組大鼠阿片肽前體mRNA表達的比較 (±s)

表7 3組大鼠阿片肽前體mRNA表達的比較 (±s)

組別 n POMC PENK PDYN Normal組 20 1.00±0.08 1.00±0.09 0.00±0.00 TEAS 組 20 2.18±0.10 0.63±0.05 0.00±0.00 CFA 組 20 1.51±0.12 0.81±0.05 0.00±0.00

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是臨床上常見的慢性、多發(fā)性、系統(tǒng)性的慢性炎性痛疾病,TEAS是治療RA的重要臨床醫(yī)療手段之一。通過貼于特定穴位的電極片,TEAS能將不同頻率和強度的脈沖電流作用于人體,產(chǎn)生與針刺穴位類似的效應(yīng),誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì),以達到更好的治療效果[19]。研究發(fā)現(xiàn),足三里穴電針治療可以減輕大鼠關(guān)節(jié)炎的足跖腫脹度,提高痛閾,降低關(guān)節(jié)滑膜細胞培養(yǎng)上清中PGE2的表達水平[20]。也有研究提出,電針足三里穴可以通過調(diào)節(jié) p-ERK1/2表達,提升大鼠的痛閾[21]。同時,足三里和昆侖穴配伍進行電針治療可以減輕由弗氏佐劑引起的慢性炎性痛,并且具有良好的治療作用[22]。本研究選取具有舒筋活絡(luò)、益氣養(yǎng)血、扶正祛邪作用的足三里穴為治療主穴,同時選配具有通利關(guān)節(jié)、舒筋活絡(luò)止痛作用的昆侖穴進行治療。結(jié)果顯示TEAS組熱痛閾、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)和足跖腫脹度較CFA組改善顯著,表明TEAS對RA有較好的鎮(zhèn)痛治療效果。

雖然TEAS的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)非常明確,但其機理研究主要局限于對炎性細胞因子等炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)上[23-24]。本研究結(jié)果也顯示TEAS組IL-6和TNF-α免疫炎性因子表達水平較CFA組顯著降低,表明TEAS對RA有良好的抗炎治療作用,且療效類似傳統(tǒng)的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥,但在降低局部炎癥組織的PGE2、IL-1β炎性因子水平方面,TEAS作用不如抗炎鎮(zhèn)痛藥[25-27]。因此,TEAS治療RA可能還存在其他的調(diào)節(jié)途徑。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,疼痛感的調(diào)節(jié)具有復(fù)雜的外周機制,其中阿片肽在外周鎮(zhèn)痛中起主要作用[27-28]。TEAS可使腦和脊髓釋放腦啡肽、內(nèi)啡肽,使脊髓釋放強啡肽,同時降低中樞神經(jīng)元細胞的敏感性,抑制傷害性傳入神經(jīng)興奮、提高痛閾、改變下行抑制系統(tǒng)核團的活性,聯(lián)合調(diào)控炎癥疼痛,從而產(chǎn)生有效的鎮(zhèn)痛效果[29-31]。研究發(fā)現(xiàn),RA患者疼痛加重的同時,其血漿中β-EP表達水平會相應(yīng)下降[32-33];注射β-EP可提高實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠的痛閾,而注射β-EP拮抗劑則會降低痛閾[34]。本研究結(jié)果顯示,TEAS能顯著上調(diào)大鼠足跖炎癥組織中POMC(2.18倍)的表達水平,能顯著上調(diào)外周β-EP(P＜0.05)的表達水平,表明 TEAS能夠選擇性地激活外周阿片系統(tǒng),其抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與外周β-EP水平的上升有關(guān)。

本研究闡明了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛(及其他類似慢性疼痛)的臨床 TEAS治療的部分機制(抗炎與鎮(zhèn)痛并舉)。在臨床上可以更好地推廣TEAS這一康復(fù)技術(shù)的應(yīng)用,避免臨床上常用的非甾體抗炎藥導(dǎo)致的嚴重毒、副作用,彌補針刺讓部分患者存在畏懼心理、不便攜帶、又有術(shù)后傷口感染風(fēng)險的缺陷。促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的康復(fù),更好地推廣應(yīng)用在肩周炎、慢性盆腔炎等慢性炎性痛病人的臨床康復(fù)中。