真空冷凍干燥法制備益生菌粉的凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

陳勝杰，高 翔，袁戎宇

(廣東怡和科潔科技有限公司，廣東佛山528000)

益生菌(Probiotic)，源自希臘語“forlife”［1］，即“益生菌”、“益生素”或“微生態(tài)調(diào)節(jié)劑”。2001年聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織與世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)對益生菌的最新定義為:“當(dāng)攝取足夠量時，可以對宿主產(chǎn)生一定有益作用的活的微生物的總稱［2］。益生菌在預(yù)防和調(diào)理腸道疾病方面具有顯著作用，足夠數(shù)量的益生菌能有效定植腸道，形成菌群優(yōu)勢，改善腸道菌群平衡［3］。

目前國內(nèi)外最常見的液體和半固體保藏方式容易造成過多的菌體失活，并對保藏溫度具有較高要求，通常要在4～10℃低溫保藏，限制了其產(chǎn)品流通［4］，真空冷凍干燥法將益生菌發(fā)酵液制成活菌制劑，是較為理想的一種保藏方法［5－6］。但由于凍干過程將活細(xì)胞暴露在額外應(yīng)激壓力下，引起活性損失。滲透休克、形成胞內(nèi)冰晶和再結(jié)晶均能引起細(xì)胞膜損傷，造成部分活細(xì)胞死亡［7－9］。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)、抑制致病菌和維持腸道內(nèi)菌群平衡的功效［10－12］，凝結(jié)芽孢桿菌凝結(jié)芽孢桿菌作為一種優(yōu)質(zhì)的益生菌，對人工胃液的酸性條件耐受性極強(qiáng)，其存活不受影響，能順利通過胃進(jìn)入腸道，從而起到益生功能［13］，釀酒酵母菌不是腸道中的固有菌群，不黏附于腸黏膜上，以活菌形式通過消化道而發(fā)揮作用，其免疫調(diào)節(jié)功能、降膽固醇以及抗氧化作用等生理功能深受關(guān)注，是人類最早利用的微生物［14］。故本研究通過單因素和正交試驗(yàn)，確定三株益生菌，即植物乳桿菌SC1、凝結(jié)芽孢桿菌XP2和釀酒酵母SA1等的復(fù)配凍干保護(hù)劑最優(yōu)組合，致力于提高益生菌的凍干存活率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌SC1(Lactobacillus plantarum SC1，縮寫L.plantarum SC1)分離自東北辣白菜湯汁中;凝結(jié)芽孢桿菌XP2(Bacillus coagulans XP2，縮寫B(tài).coagulans XP2)分離于奶牛養(yǎng)殖場土壤中，釀酒酵母菌SA1(Saccharomyces cerevisiae SA1，縮寫S.cerevisiae SA1)購自安琪酵母科技公司并馴化，均保藏于廣東怡和科潔科技有限公司菌種保藏室;脫脂乳粉 購自天貓超市旗艦店;低聚木糖 購自山東龍力生物有限公司;可溶性淀粉 購自天貓超市旗艦店;VC鈉鹽、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和瓊脂 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZWY－210C恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司;SW－CJ－1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化;FD－1D－50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)儀器有限公司;752型分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;pH儀 美國Mettler Toledo公司;FA1004分析天平 廣州天平儀器;YXQ－50A立式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫(yī)療器械有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.58 g/L。若制作固體培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉即可。

YPD培養(yǎng)基:蛋白胨20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L。若制作固體培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉即可。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 選取對凍干后菌株存活率有影響的備選保護(hù)劑共4個，分別為脫脂乳粉［15］、低聚木糖［16］、可溶性淀粉［17］和VC鈉鹽［18］，其水平選擇即參考相關(guān)文獻(xiàn)，也有本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)做基礎(chǔ)，進(jìn)行合理選取，并對單因素結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的正交因素水平表，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，評判標(biāo)準(zhǔn)均以對菌株存活率的正向影響為指標(biāo)。

1.3.1.1 脫脂乳粉添加量對菌體存活率影響 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、8%、12%、16%和20%的脫脂乳粉，與穩(wěn)定期初期的菌體以體積比1∶1混和均勻，制成菌懸液，放入真空凍干燥機(jī)中，先在－70℃預(yù)冷凍2 h，然后調(diào)整凍干溫度為－50℃、真空度10 Pa，進(jìn)行凍干38 h［19］，得到益生菌凍干粉。

1.3.1.2 低聚木糖添加量對菌體存活率影響 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、5%、8%、10%和12%的低聚木糖，與穩(wěn)定期初期的菌體以體積比1∶1混和均勻，制成菌懸液，放入真空凍干燥機(jī)中，先在－70℃預(yù)冷凍2 h，然后調(diào)整凍干溫度為－50℃、真空度10 Pa，凍干38 h，得到益生菌凍干粉。

1.3.1.3 可溶性淀粉添加量對菌體存活率影響 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、8%、12%、15%和18%的可溶性淀粉，與穩(wěn)定期初期的菌體以體積比1∶1混和均勻，制成菌懸液，放入真空凍干燥機(jī)中，先在－70℃預(yù)冷凍2 h，然后調(diào)整凍干溫度為－50℃、真空度10 Pa，凍干38 h，得到益生菌凍干粉。

1.3.1.4 VC鈉鹽添加量對菌體存活率影響 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%的VC鈉鹽，與穩(wěn)定期初期的菌體以體積比1∶1混和均勻，制成菌懸液，放入真空凍干燥機(jī)中，先在－70℃預(yù)冷凍2 h，然后調(diào)整凍干溫度為－50℃、真空度10 Pa，凍干38 h，得到益生菌凍干粉。

1.3.2 正交試驗(yàn) 選擇活菌率高的保護(hù)劑采用正交設(shè)計(jì)法進(jìn)一步優(yōu)化，以確定保護(hù)劑最佳組成，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，其中SC1代表植物乳桿菌SC1，XP2代表凝結(jié)芽孢桿菌XP2，SA1代表釀酒酵母SA1。

表1 益生菌凍干保護(hù)劑L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels table of L9(34)orthogonal experiment of freeze－drying protectant for probiotic

1.3.3 細(xì)菌存活率測定 稱取適量凍干粉，并向粉中加入與凍干前等體積的生理鹽水(0.9%，w/v)進(jìn)行復(fù)水，采用稀釋涂布平板法計(jì)算活菌數(shù)，其中凝結(jié)芽孢桿菌和植物乳桿菌均采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［20］，釀酒酵母采用YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算其存活率，平行3次試驗(yàn)。其中，

菌株存活率(%)=V凍干后/V凍干前×100

式中，V凍干后表示凍干后的活菌數(shù)，V凍干前表示凍干前的活菌數(shù)［21］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 4.0進(jìn)行極差分析，每組數(shù)據(jù)三次平行，并進(jìn)行顯著性分析。采用Origin 8.0進(jìn)行相關(guān)圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 脫脂乳粉添加量對三種益生菌凍干存活率的影響 脫脂乳粉添加量對三種益生菌凍干存活率的影響見圖1，隨著脫脂乳粉濃度的增加，植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌三種菌的存活率均逐漸增加，但是當(dāng)增加到一定濃度后菌體的存活率保持穩(wěn)定或些許下降，從成本角度考慮，真空冷凍干燥植物乳桿菌SC1(L.plantarum SC1)、凝結(jié)芽孢桿菌XP2(B.coagulans XP2)和釀酒酵母菌SA1(S.cerevisiae SA1)的凍干保護(hù)劑脫脂乳粉添加量最優(yōu)值分別選擇12%、8%和12%。

圖1 脫脂乳粉添加量對益生菌凍干存活率的影響Fig.1 Effect of addition amount of skimmed milk powder on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.2 低聚木糖添加量對三種益生菌凍干存活率的影響 低聚木糖添加量對三種益生菌凍干存活率的影響，結(jié)果見圖2，隨著低聚木糖濃度的增加，植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌三種菌的存活率均逐漸增加，但是當(dāng)增加到一定濃度后菌體的存活率保持穩(wěn)定或些許下降，從成本角度考慮，真空冷凍干燥植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌的凍干保護(hù)劑低聚木糖添加量最優(yōu)值分別選擇10%、8%和10%。

圖2 低聚木糖添加量對益生菌凍干存活率的影響Fig.2 Effect of addition amount of xylo－oligosaccharide on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.3 可溶性淀粉添加量對三種益生菌凍干存活率的影響 可溶性淀粉添加量對三種益生菌凍干存活率的影響，結(jié)果見圖3，隨著可溶性淀粉濃度的增加，植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌三種菌的存活率均逐漸增加，但是當(dāng)增加到一定濃度后菌體的存活率保持穩(wěn)定或些許下降，從成本角度考慮，真空冷凍干燥植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌的凍干保護(hù)劑可溶性淀粉添加量最優(yōu)值分別選擇15%、12%和10%(釀酒酵母選擇可溶性淀粉添加量為10%，主要是因?yàn)閱我蛩亟Y(jié)果中，從8%～12%的添加量對細(xì)菌存活率具有一定提升，但幅度較小，綜合效果和成本因素，雖然沒有做10%的實(shí)驗(yàn)，但仍選擇中間值10%作為最佳值。

圖3 可溶性淀粉添加量對益生菌凍干存活率的影響Fig.3 Effect of addition amount of soluble starch on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.4 VC鈉鹽添加量對三種益生菌凍干存活率的影響 VC鈉鹽添加量對三種益生菌凍干存活率的影響，結(jié)果見圖4，隨著VC鈉鹽濃度的增加，植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌三種菌的存活率均逐漸增加，但是當(dāng)增加到一定濃度后菌體的存活率保持穩(wěn)定或些許下降，從成本角度考慮，真空冷凍干燥植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌的凍干保護(hù)劑VC鈉鹽添加量最優(yōu)值分別選擇2%、3%和2%。

2.1.5 單因素顯著性分析結(jié)果 采用SPSS 4.0對三株菌分別與脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽之間進(jìn)行單因素顯著性分析，結(jié)果見表2～表4。

由表2可知，脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽對植物乳桿菌的存活率都有極顯著性的差異。因此選擇脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽做正交實(shí)驗(yàn)。由表3可知，脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽對凝結(jié)芽孢桿菌的存活率都有極顯著性的差異。因此選擇脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽做正交實(shí)驗(yàn)。表4可知，脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽對釀酒酵母菌的存活率都有極顯著性的差異。因此選擇脫脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽做正交實(shí)驗(yàn)。

表2 植物乳桿菌的單因素顯著性分析結(jié)果Table 2 The results of single factor significance analysis of L.plantarum SC1

表3 凝結(jié)芽孢桿菌的單因素顯著性分析結(jié)果Table 3 The results of single factor significance analysis of B.Coagulans XP2

表4 釀酒酵母菌的單因素顯著性分析結(jié)果Table 4 The results of single factor significance analysis of S.cerevisiae SA1

圖4 VC鈉鹽添加量對益生菌凍干存活率的影響Fig.4 Effect of addition amount of VC salt on freeze－dried survival rate of probiotics

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定各保護(hù)劑的正交水平數(shù)，確定四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)表，并用SPSS軟件進(jìn)行極差和方差分析。結(jié)果如表5～表10所示。

由表5可知，不同的保護(hù)劑添加量對植物乳桿菌凍干存活率有著不同的影響。各保護(hù)劑因素對益生菌真空冷凍干燥粉劑的存活率影響大小從大到小順序排列:C＞D＞A＞B，保護(hù)劑添加量最佳組合為:C1D3A2B3，即可溶性淀粉10%，VC鈉鹽3%，脫脂乳粉12%，低聚木糖14%。由表6可知，四個保護(hù)劑的F值均小于0.05，說明對植物乳桿菌凍干存活率均具有顯著影響。

由表7可知，不同的保護(hù)劑添加量對凝結(jié)芽孢桿菌凍干存活率有著不同的影響。各保護(hù)劑因素對益生菌真空冷凍干燥粉劑的存活率影響大小從大到小順序排列:B＞D＞C＞A，保護(hù)劑添加量最佳組合為:B2D3C3A2，即低聚木糖8%，VC鈉鹽4%，可溶性淀粉14%，脫脂乳粉8%。由表8可知，四個保護(hù)劑的P值均小于0.05，說明對凝結(jié)芽孢桿菌凍干存活率均具有顯著影響。

由表9可知，不同的保護(hù)劑添加量對釀酒酵母菌凍干存活率有著不同的影響。各保護(hù)劑因素對益生菌真空冷凍干燥粉劑的存活率影響大小從大到小順序排列:B＞D＞A＞C，保護(hù)劑添加量最佳組合為:B2D2A2C3，即低聚木糖10%，VC鈉鹽2%，脫脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。由表10可知，四個保護(hù)劑的P值均小于0.05，說明對釀酒酵母菌凍干存活率均具有顯著影響。

2.3 最優(yōu)組合效果重復(fù)驗(yàn)證

三株菌分別添加最優(yōu)復(fù)配凍干保護(hù)劑，進(jìn)行真空冷凍干燥，檢測凍干后活菌數(shù)，并計(jì)算菌株存活率，具體結(jié)果見圖5。由圖5可知，在最優(yōu)復(fù)配凍干保護(hù)劑作用下，凍干存活率分別為植物乳桿菌SC1 83.2%，凝結(jié)芽孢桿菌XP2 83.7%，釀酒酵母菌SA1 86.7%，有 效 活 菌 數(shù) 分 別 為6.3×108、5.7×108、3.5×108CFU/g，均大于108CFU/g，具有較好的市場價值。

表8 凝結(jié)芽孢桿菌L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 8 The variance analysis of L9(34)orthogonal experiment on B.coagulans XP2

表9 釀酒酵母菌L9(34)正交實(shí)驗(yàn)極差分析Table 9 The range analysis of L9(34)orthogonal experiment on S.cerevisiae SA1

3 討論與結(jié)論

不同的保護(hù)劑對細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制有所不同，合理復(fù)配不同類型的保護(hù)劑，可以有效提高真空干燥凍干發(fā)酵劑中活菌存活率［22－24］，本實(shí)驗(yàn)對四個候選凍干保護(hù)劑進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)組合，Carvalho等［25］研究表明脫脂乳粉能穩(wěn)定細(xì)胞膜，提供細(xì)胞保護(hù)衣以免細(xì)胞損傷，可以單獨(dú)使用或與其他保護(hù)劑混合使用均具良好效果。陳合等［26］研究表明在添加了7%的低聚木糖的復(fù)配凍干保護(hù)劑后，兩雙歧桿菌的凍干存活率提高到了88.7%;王媚等［27］將10%的可溶性淀粉與其它成分復(fù)配，微生態(tài)制劑凍干后活菌數(shù)高達(dá)2.33×1010CFU/pb，田芬等［28］通過添加適量VC鈉鹽與其它成分復(fù)配，可使雙歧桿菌和乳酸菌均達(dá)到85%以上的凍干存活率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不同的菌株對凍干保護(hù)劑的復(fù)配配方需求也不盡相同，比例也各有差別，說明菌株本身的特性也是影響保護(hù)劑選擇的主要因素。牛春華等［21］研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌在可溶性淀粉14%，低聚木糖12%，谷氨酸鈉3%，菊糖15%的復(fù)配保護(hù)劑下，凍干存活率為65.2%，低于本文的83.2%。戚薇等［29］研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌在脫脂乳15%，谷氨酸鈉1%的復(fù)配保護(hù)劑下，凍干存活率為77%，低于本文的83.7%。張冬生等［30］研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在蔗糖144.4 g/L，脫脂奶粉100.8 g/L，聚乙二醇11.1 g/L的復(fù)合保護(hù)劑下，凍干存活率為80.81%，低于本文的86.7%。綜上，本研究得到的復(fù)配劑配方具有一定的借鑒意義。另外，目前應(yīng)用較為廣泛的另一種益生菌粉制作方法－噴霧干燥法，文獻(xiàn)顯示，Her等［31］使用噴霧冷凍干燥法制備獲得了存活率高達(dá)97.7%的一種益生菌粉，但費(fèi)用較昂貴。Semyonov等［32］發(fā)現(xiàn)利用超聲波真空噴霧干燥技術(shù)能夠有效制得包埋有干酪乳桿菌的微膠囊，存活率最高達(dá)到70.6%。真空冷凍干燥法與噴霧干燥法相比，具有一定優(yōu)勢，成本適中，凍干存活率高等。

表10 釀酒酵母菌L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 10 The variance analysis of L9(34)orthogonal experiment on S.cerevisiae SA1

圖5 最優(yōu)凍干保護(hù)劑組合下的三株菌凍干存活率和有效活菌數(shù)Fig.5 The lyophilized survival rate and effective viable count of three strains under the optimum combination of Lyophilized protectants

本研究得出植物乳桿菌保護(hù)劑最佳配方組合為:可溶性淀粉10%，VC鈉鹽3%，脫脂乳粉12%，低聚木糖14%;凝結(jié)芽孢桿菌保護(hù)劑配方最佳組合為:低聚木糖8%，VC鈉鹽4%，可溶性淀粉14%，脫脂乳粉8%;釀酒酵母菌保護(hù)劑配方最佳組合為:低聚木糖10%，VC鈉鹽2%，脫脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。在最優(yōu)配方保護(hù)劑下，三株菌的凍干存活率分別 為83.2%、83.7%和86.7%，活 菌 數(shù) 均 高 于1.0×108CFU/g，具有較好的應(yīng)用價值。