枯草芽孢桿菌對(duì)大豆蛋白 磷脂復(fù)合乳液在體外消化中穩(wěn)定性的影響

劉 雪，管軍軍，朱 浩，崔耀明，冀旭陽(yáng)，鄭建樟，路新開(kāi)

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001)

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)是目前可 以取代動(dòng)物性蛋白，蛋白含量最高的植物性蛋白。另外，它還具有良好的發(fā)泡、凝膠、乳化等特性［1］，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性在食品配方中應(yīng)用廣泛，尤其是乳化特性應(yīng)用最為廣泛。大豆分離蛋白具有兩性基團(tuán)，可以親水親油形成穩(wěn)定的水包油(O/W)型乳液，但作為醫(yī)用物質(zhì)載體，要有極高的穩(wěn)定性，因此有研究者引入同樣具有兩性基團(tuán)的磷脂，與SPI相比，磷脂更易與油脂結(jié)合，可以形成油包水(W/O)型的乳液，幫助SPI形成更穩(wěn)定的兩相界面，增加乳液的穩(wěn)定性［2－3］。因此，大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液作為傳遞和包封營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)穩(wěn)定載體廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。

近年來(lái)，枯草芽孢桿菌作為綠色微生態(tài)制劑菌種的研究應(yīng)用也十分廣泛［4］?？莶菅挎邨U菌是厭氧益生菌，其孢子能在極酸的胃生態(tài)環(huán)境中保持活性，進(jìn)入腸道，調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道生態(tài)平衡［5－7］，其分泌的淀粉酶、蛋白酶等，也可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)［8－9］，但其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的具體作用機(jī)制還尚不清楚。而大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液的成分簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以作為研究對(duì)象，探究枯草芽孢桿菌對(duì)大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液在消化中的作用，為進(jìn)一步分析枯草芽孢桿菌對(duì)乳液中蛋白和油脂的具體作用機(jī)制奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

動(dòng)物消化試驗(yàn)是還原營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收最有效的方法，但其成本高，影響因素復(fù)雜，而體外消化方法相比體內(nèi)消化方法更快捷，更簡(jiǎn)單［10－11］。目前，靜態(tài)消化模型是使用最廣泛的體外消化模型，多用于簡(jiǎn)單成分的食品消化研究［12］，適合采用此消化模型探究枯草芽孢桿菌對(duì)大豆蛋白磷脂復(fù)合乳液穩(wěn)定性的影響。乳液在口腔中停留的時(shí)間極短，枯草芽孢桿菌作用有限，所以本試驗(yàn)以大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液為研究對(duì)象，只探討枯草芽孢桿菌在胃腸消化過(guò)程中對(duì)其穩(wěn)定性的影響，對(duì)促進(jìn)大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液和益生菌的應(yīng)用等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆 鄭州丹尼斯超市購(gòu);大豆油(金龍魚(yú)精煉一級(jí))益海嘉里食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司;粉末磷脂 純度:丙酮不溶物含量≥98%，鄭州四維科技有限公司;α－淀粉酶 盈芯生物科技(上海)有限公司;胃蛋白酶 10000 NFU/mg，生工生物工程(上海)股份有限公司;脂肪酶 活性20000 U/g，北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶 Sigma－Aldrich貿(mào)易有限公司;膽鹽 Sigma－Aldrich貿(mào)易有限公司;枯草芽孢桿菌BS－GA15 由潤(rùn)盈生物工程(上海)有限公司提供;磷酸二氫鉀等化學(xué)試劑 均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司等。

FA25高剪切分散乳化機(jī) 德國(guó)FLUKO公司;HH－4型恒溫水浴鍋 河南智城科技發(fā)展有限公司;722N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;FD－1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;85－2型恒溫磁力攪拌器 河南智城科技發(fā)展有限公司;JP－100A－2高速多功能粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司;BH200生物顯微鏡 舜宇光學(xué)科技集團(tuán)有限公;索氏抽提儀 鄭州欣豐化玻儀器有限公司;DSX－30L型高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備 參考文獻(xiàn)方法［13－14］，略作修改:精選大豆粉碎后過(guò)60目篩得大豆粉于索氏抽提儀中用石油醚脫脂，所得脫脂豆粉與蒸餾水(1∶10)混合置于磁力攪拌器上室溫下攪拌1 h，之后用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到8.0后將所得溶液置于60℃水浴下繼續(xù)攪拌1 h，加速其溶解，然后離心(5000 r/min)30 min，取上清液后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.8，4℃冷藏12 h后離心(5000 r/min)30 min，取下層沉淀冷凍干燥，可得酸性SPI，將所得SPI置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液體系的制備 參考江連洲等［15－17］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取2%SPI溶于57%蒸餾水中，用NaOH(2 mol/L)調(diào)節(jié)pH到7.0，高速剪切分散乳化機(jī)(21000 r/min)乳化60 s。稱(chēng)1%磷脂加熱溶解于40%大豆油中，乳化60 s，然后將二者混合，再乳化120 s可得大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液，制成O/W型乳液。方法同上，稱(chēng)取2%SPI、37%蒸餾水、1%磷脂和60%大豆油，制成W/O型乳液，備用。

1.2.3 枯草芽孢桿菌菌液的制備 將實(shí)驗(yàn)室自制的枯草芽孢桿菌菌粉在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液［18］(0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl、100 mL蒸餾水)中32℃培養(yǎng)24 h后用平板涂布法進(jìn)行純化，將純化的單一菌落取出，液體培養(yǎng)12 h后4℃保存?zhèn)溆?，活菌?shù)約為4×107CFU/mL。

1.2.4 消化液的制備 依照文獻(xiàn)［19－20］配制唾液、胃液和小腸液:配方如表1，按照配方的比例將各物質(zhì)(α－淀粉酶、胃蛋白酶、脂酶和胰酶在使用前加入)加入到500 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，作為母液備用。

1.2.5 模擬胃腸靜態(tài)消化模型的建立 根據(jù)人體消化特點(diǎn)，參考文獻(xiàn)［20－21］建立胃腸消化模型，取200 mL乳液和14 mL枯草芽孢桿菌菌液加到錐形瓶中混勻［22］。再在混合好的溶液里加入200 mL含淀粉酶的唾液，37℃條件下攪拌5 min來(lái)模擬乳液在口腔中消化。稱(chēng)取0.16 g胃蛋白酶加入400 mL胃液母液中混勻后水浴加熱至37℃加入錐形瓶中，用水浴振蕩的方式模擬胃的運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)速為60 r/min，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)4 h后將準(zhǔn)備好的小腸液加入錐形瓶中繼續(xù)振蕩16 h。在不同的消化時(shí)間點(diǎn)取樣后立即進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 EAI和ESI的測(cè)定 參照Pearce等［23－24］的方法，用10 mL 0.1%SDS溶液稀釋混勻，在500 nm處測(cè)定稀釋液的吸光度A0，靜置30 min后測(cè)得吸光度為A30，計(jì)算EAI和ESI，公式如下:

式中，T為常數(shù)2.303;N為稀釋倍數(shù);ρ為乳液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度，g/mL;φ為乳液中油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 消化液的組成及濃度Table 1 Composition and concentration of digestive juice

1.2.7 粒徑和Zeta電位的測(cè)量 參考Chanamai等［25］的方法，稍有改動(dòng)。按時(shí)間點(diǎn)取樣后用蒸餾水稀釋500倍，取適量稀釋液于樣品槽中，將儀器測(cè)定溫度設(shè)置為25℃。粒徑的乳液相對(duì)折射率設(shè)置為1.095(大豆油(1.456)與水相(1.33)的折射率之比)。單個(gè)樣品的粒徑與電位的測(cè)量次數(shù)為3次，結(jié)果取3次測(cè)量結(jié)果的平均值。

1.2.8 顯微觀察 取樣后立即吸取20μL樣品均勻涂于載玻片上，在顯微鏡下用16×40倍鏡觀察乳液形態(tài)并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行初步整理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SAS 9.0軟件進(jìn)行單因素和多因素方差分析，P＜0.05時(shí)差異顯著，用Origin 9.1軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳化活性指數(shù)(EAI)分析

乳化活性指數(shù)(EAI)表示每單位重量蛋白質(zhì)能穩(wěn)定的界面面積，反映蛋白質(zhì)吸收至油水界面的能力［26］。影響EAI的因素有很多，如溫度、水溶性、液滴分布等，但最主要是蛋白結(jié)構(gòu)。由圖1A可以看出，大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液在胃消化模型中前120 min急劇降低，說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)該復(fù)合乳液的作用極強(qiáng)。蛋白降解致其表面結(jié)構(gòu)被破壞，可能暴露出多余的親水基團(tuán)，使得EAI降低［27］。另一面，蛋白的親油基團(tuán)也可能被降解，結(jié)合磷脂和油脂的能力降低，EAI也會(huì)降低。圖1B顯示乳液在加入小腸液后，乳液的EAI整體呈上升趨勢(shì)，在這個(gè)過(guò)程中，油脂被降解，大顆粒油滴包被的蛋白暴露，形成二次乳化，乳液的EAI上升。由圖1可以看出，O/W型乳液的EAI整體大于W/O型，經(jīng)分析差異顯著(P＜0.05)，可能是因?yàn)橛椭扛?，降低了蛋白的乳化特性。還可以看出，加入枯草芽孢桿菌的乳液的EAI整體偏低，說(shuō)明枯草芽孢桿菌的加入促進(jìn)乳液破乳的現(xiàn)象，可能是枯草芽孢桿菌在乳液中破壞了大豆蛋白結(jié)構(gòu)，或間接增加了胃蛋白酶的活性。

圖1 不同消化時(shí)間下乳液EAI的變化Fig.1 Changes in EAI of emulsions at different digestion time

2.2 乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)

乳化穩(wěn)定指數(shù)則表示一定時(shí)間內(nèi)乳液不分層的能力，主要與乳液液滴的表面張力和液滴間的排斥力有關(guān)［28］。由圖2A顯示，在胃蛋白酶作用下，乳液穩(wěn)定性降低，尤其是對(duì)W/O型乳液的作用最為明顯，可能是蛋白降解，承載油滴的能力下降，W/O型乳液的油滴表面積大，表面張力也大，更容易聚集、上浮，則乳液穩(wěn)定性更易降低。圖2B顯示O/W型乳液在小腸消化階段的前7 h ESI增加，7 h之后有降低的趨勢(shì)，但差異不明顯，而W/O型乳液的ESI在前4 h持續(xù)增加，4 h之后出現(xiàn)大幅度波動(dòng)，13 h之后基本穩(wěn)定?？赡苁荗/W型乳液的消化一直是脂酶、胰酶起主導(dǎo)作用，消化后期，油脂被大量降解，蛋白絮凝，電荷減少，ESI降低［29］。而W/O型乳液的消化后期，乳液中的油脂降解速度減緩，油滴含量高，聚集的現(xiàn)象起主導(dǎo)作用，隨著油脂、蛋白繼續(xù)降解，聚集現(xiàn)象減少，ESI增加，如此反復(fù)，就出現(xiàn)了波動(dòng)性變化。由圖2可以看出，在消化階段加枯草芽孢菌的乳液ESI比不加菌的乳液低(P＜0.05)，可能是枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，需要能量，消耗了大豆分離蛋白，降低了液滴間的排斥力，增加了破乳現(xiàn)象。

圖2 不同消化時(shí)間下乳液ESI的變化Fig.2 ESI changes of emulsions at different digestion time

2.3 乳液的電位結(jié)果

乳液的電位指的是乳液液滴和分散溶液之間的電位差，用來(lái)表達(dá)液滴之間的靜電排斥力大小，排斥力越大，乳液結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定［30－31］。由圖3A可以看出加入唾液、胃液的乳液的初始電位值為正值，隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)，電位減小。加入小腸液之后，電位值變?yōu)樨?fù)數(shù)，隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)，電位絕對(duì)值增加，O/W型乳液在7 h后電位絕對(duì)值降低，而W/O型乳液在腸消化4 h之后出現(xiàn)波動(dòng)性變化。加入枯草芽孢桿菌的乳液在消化過(guò)程中電位絕對(duì)值要小于不加菌的乳液。整體趨勢(shì)基本與乳液的ESI相呼應(yīng)。胃液中含有大量的H+，中和了乳液中的陰離子，減小液滴之間的排斥力，促進(jìn)液滴聚合，表面帶電荷減少，電位值降低，穩(wěn)定性減小［32］。而小腸液為中性，中和胃酸，使蛋白帶負(fù)電，前期隨著油脂被降解，蛋白暴露，電荷增加，穩(wěn)定性增加?？莶菅挎邨U菌對(duì)乳液電位值的變化也有影響。一方面，枯草芽孢桿菌可能是通過(guò)破壞蛋白或磷脂來(lái)加快破乳，間接促進(jìn)電位值增加，另一方面，枯草芽孢桿菌可能代謝產(chǎn)酸，加劇了乳液的聚合現(xiàn)象，電位值升高［33］。

2.4 乳液的粒徑及顯微觀察分析

圖3 不同消化時(shí)間下乳液電位的變化Fig.3 Changes in emulsion potential at different digestion time

圖4 不同消化時(shí)間下乳液粒徑的變化Fig.4 Changes in particle size of emulsions at different digestion time

圖5 不同消化時(shí)間O/W型油滴的形態(tài)Fig.5 Morphology of O/W emulsion at different digestion time

圖6 不同消化時(shí)間W/O型乳液的油滴形態(tài)Fig.6 Morphology of W/O emulsion at different digestion time

大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液在消化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)分離、聚合、絮凝和上浮等現(xiàn)象，則粒徑就是用來(lái)衡量液滴的聚集程度的［34］。圖4反映的是乳液在不同消化時(shí)間點(diǎn)的平均粒徑，結(jié)合圖5、圖6乳液的油滴形態(tài)圖進(jìn)行分析。由圖4A可以看出乳液的平均粒徑隨胃消化時(shí)間逐漸減小，而在圖4B顯示的小腸消化中，O/W型乳液在7 h之前逐漸減小，7 h之后趨于平穩(wěn)，W/O型乳液在4 h之前減小，4 h之后呈波動(dòng)性變化，與ESI、電位值的測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明O/W型乳液在腸消化7 h左右最穩(wěn)定，而W/O型乳液則在4 h左右就達(dá)到穩(wěn)定。在胃消化期間，粒徑降低，可能是因?yàn)榧尤胛傅鞍酌负螅鞍籽杆俳到?，使乳液中油滴及油滴包被的部分蛋白聚合上浮，乳液中只留下小分子量的蛋白和油滴。加入胰酶、脂酶和膽鹽后，胰脂酶的吸附，脂質(zhì)水解，膽鹽和界面膜的相互作用，使乳液粒徑產(chǎn)生很大變化［35－37］。上浮的油滴重新回到乳液中被降解，分子量減小，進(jìn)行二次乳化，此時(shí)分離現(xiàn)象大于聚合現(xiàn)象，粒徑減小。O/W型乳液后期，蛋白油脂含量降低，其分離現(xiàn)象減弱，粒徑變化不大，而W/O型乳液后期分離現(xiàn)象也會(huì)減弱，但相較于O/W型乳液，含油量較高，其聚合能力遠(yuǎn)超O/W型乳液，因此形成了后期的顯著性波動(dòng)。由圖4可知，加菌乳液的整體平均粒徑低于不加菌乳液。與EAI、ESI、電位測(cè)得結(jié)果一致，說(shuō)明加入枯草芽孢桿菌后加速了乳液在胃腸消化中的破乳現(xiàn)象。

圖5、圖6則顯示了乳液在胃腸消化中的起始變化，可以看出，消化初期，乳液密度大，油滴小，但測(cè)得粒徑大，可能是因?yàn)槿橐阂旱畏稚⒉痪?，成簇聚集。胃消?40 min時(shí)，密度小，說(shuō)明油滴上浮，濁度減小。加入小腸液之后，密度迅速增加，說(shuō)明上浮的油滴再次進(jìn)入乳液，形成了二次乳化，腸消化16 h之后，油滴直徑更小，且密度低。由圖5、圖6可以看出，加枯草芽孢桿菌的油滴直徑略小于不加菌，且W/O型乳液的油滴大于O/W型乳液。與上述測(cè)定的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

O/W型和W/O型乳液在胃消化過(guò)程中，粒徑、電位、EAI和ESI減小，而在小腸消化前期，EAI和ESI增加，粒徑和電位降低，在消化后期，O/W型乳液的各項(xiàng)指標(biāo)基本趨于平穩(wěn)，W/O型乳液的先呈波動(dòng)性變化后趨于平穩(wěn)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加入枯草芽孢桿菌對(duì)大豆蛋白－磷脂復(fù)合乳液在消化過(guò)程中的破乳現(xiàn)象有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)，說(shuō)明枯草芽孢桿菌可能在生長(zhǎng)的過(guò)程消耗了乳液中的蛋白，或者其分泌的代謝產(chǎn)物增加了酶活，可進(jìn)一步探究枯草芽孢桿菌對(duì)乳液的作用機(jī)理。