冠突散囊菌發(fā)酵對葛根的活性物質(zhì)和抗氧化活性的影響

杜 靜，王琪琪，王云勝，張傳博

(貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽550001)

葛根具有極高藥用價值的同時還具有營養(yǎng)保健功效，是一種“藥食同源”的植物［1－2］。它含有豐富的活性成分，尤其是研究最為廣泛的異黃酮類物質(zhì)，包括葛根素、芒柄花素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素等，具有廣泛的抗氧化活性，在治療心腦血管疾病及改善血脂等方面有著巨大潛力［3－5］。葛根異黃酮的存在形式一般有兩種，游離型苷元和結(jié)合型糖苷，前者包括大豆苷元等，后者包括葛根素和大豆苷等［6－8］，此外有研究表明，苷元型異黃酮生物活性更強，且異黃酮多以苷元型在體內(nèi)發(fā)揮作用［9－11］。

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)作為茯磚茶“發(fā)花”工藝中的優(yōu)勢菌，是一種重要的藥用真菌，它能分泌多種酶，包括多酚氧化酶、單寧酶、纖維素酶、蛋白酶等，具有降脂、抗氧化等多種醫(yī)療保健功能，且對營養(yǎng)環(huán)境沒有特殊要求，易于生長［12－13］。同時有文獻以發(fā)酵培養(yǎng)的方式對該菌的次級代謝產(chǎn)物及其生物活性進行研究，表明其代謝產(chǎn)物具有很強的抗氧化作用［14］。

目前已有研究證實可用微生物轉(zhuǎn)化葛根，諸如利用黑曲霉、香菇、紅曲霉等轉(zhuǎn)化葛根以生產(chǎn)黃酮等，或研制靈芝發(fā)酵顆粒沖劑等，且有研究表明經(jīng)發(fā)酵葛根的抗氧化能力也會得到提高［15－19］。但大部分研究都基于葛根渣或者使用一些常見菌種進行發(fā)酵。在前人的研究基礎之下，本研究選用茯磚茶中的優(yōu)勢菌冠突散囊菌發(fā)酵葛根，探究冠突散囊菌發(fā)酵對葛根的影響，對比發(fā)酵前后葛根部分活性成分以及抗氧化活性的變化，以期為葛根資源的進一步開發(fā)及中藥現(xiàn)代化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冠突散囊菌(Eurotium cristatum) 分離自陜西茯磚茶，為貴州師范大學微生物重點實驗室分離保存菌種;鮮葛根 由貴州省隆熙源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，經(jīng)實驗室切片、35℃烘干處理備用;蘆丁標準品、葛根素標準品、大豆苷標準品、大豆苷元標準品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基肼(DPPH)、抗壞血酸、色譜級甲醇 天津市恒興化學試劑制造有限公司;娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;其他試劑 均為分析純。

RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海洪旋實驗儀器有限公司;FS－600N超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司;DH6000II電熱恒溫培養(yǎng) 天津市泰斯特儀器有限公司;UV759CRT紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌孢子懸浮液制備 參照胡謝馨等［20］的方法，略有改動。將冠突散囊菌接種于PDA培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后刮取冠突散囊菌孢子放入盛有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，120 r/min搖床振蕩30 min，最終稀釋成濃度4×106個/mL孢子懸浮液待用。

1.2.2 固體發(fā)酵 采用胡謝馨等［20］的方法，略有改動。取冠突散囊菌孢子懸浮液，分別接種到葛根固體發(fā)酵基質(zhì)(干葛根片40 g，水40 mL)和大米固體發(fā)酵基質(zhì)(大米40 g，水50 mL)上，接種量為培養(yǎng)基的重量的5%，28℃恒溫培養(yǎng)。接種10 d左右，基質(zhì)已布滿冠突散囊菌菌絲，生長達到旺盛，發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 葛根發(fā)酵物的提取制備 參照肖楠等［21］的方法，略有改變，提取制備發(fā)酵產(chǎn)物。將發(fā)酵產(chǎn)物，即發(fā)酵后得到的復合物，于30℃烘干、粉碎，稱取10 g粉碎后的產(chǎn)物，采用醇提法進行提取(95%乙醇，料液比1∶10，浸泡過夜后超聲提取三次)，抽濾去其殘渣，將提取液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得浸膏，記做FG。以大米培養(yǎng)基發(fā)酵的冠突散囊菌和未發(fā)酵的葛根作對照，按照同樣的方法提取，分別記做DM和WG。

1.2.4 總黃酮含量測定 采用紫外分光光度法測量葛根發(fā)酵前后提取物的總黃酮含量［22－23］。以蘆丁為標準品(0.2 mg/mL)，并配制成系列濃度，于510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。取待測樣品于相同條件下測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算其總黃酮含量。

1.2.5 葛根發(fā)酵前后異黃酮含量的HPLC分析

1.2.5.1 色譜條件 參照楚紀明等［24］的方法和藥典［25］并進行改變，色譜條件如下:Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相水(A)－甲醇(B)，梯度洗脫(0～20 min，25%B;20～50 min，25%～55%B;50～80 min，55%～25%B);檢測波長250 nm;柱溫30℃;流速0.7 mL/min;進樣量10μL。

1.2.5.2 溶液制備 各提取物用50%甲醇溶解稀釋成所需質(zhì)量濃度，即為供試樣品溶液;精密稱取葛根素、大豆苷、大豆苷元標準品各5 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，即為混合對照品溶液。

1.2.5.3 方法專屬性考察 分別取“1.2.5.2”項下的供試樣品溶液和混合標準品溶液，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣。

1.2.5.4 線性關(guān)系考察 分別取“1.2.5.2”項下的混合對照品溶液1、2、3、4、5 mL，用50%甲醇定容至10 mL，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣。

1.2.5.5 方法學考察 參考邵建兵［26］、高晗［27］、姚少姿［28］等的方法，進行方法學考察。精密度試驗:取“1.2.5.2”項下的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算各標準品峰面積的RSD;重復性試驗:按“1.2.5.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.5.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算RSD;穩(wěn)定性試驗:取供試樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄峰面積，計算各標準品的含量與RSD;加樣回收率試驗:取已知含量的樣品，加入一定量各標準品，照“1.2.3”項條件重新提取，并制備供試樣品溶液，按“1.2.5.1”項色譜條件進樣，計算加樣回收率及RSD。

1.2.6 體外抗氧化能力測定 采用DPPH法［29－32］測定發(fā)酵前后葛根的體外抗氧化活性。取2 mL各濃度樣品，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩搖勻，室溫下避光反應30 min，于517 nm處測其吸光值，記做Ai;以等量的甲醇代替DPPH溶液，相同條件下測得吸光值，記做Aj;以等量的50%甲醇代替樣品溶液，相同條件下測得吸光值，記做Ac。每個組實驗做3個平行，以相同濃度的抗壞血酸溶液做參照，用甲醇溶液調(diào)零。DPPH自由基清除率的計算公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，GraphPad Prism7.0作圖并計算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量測定

在葛根基質(zhì)上冠突散囊菌長勢良好，在接種的第2 d就有明顯的白色菌絲產(chǎn)生，且較PDA培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基長勢更快，說明葛根能為冠突散囊菌提供其所需的各種營養(yǎng)成分。對葛根發(fā)酵前后的總黃酮含量測定結(jié)果如下:以量取的蘆丁標準溶液的體積為橫坐標(X)，吸光值為縱坐標(Y)進行回歸，得到線性回歸方程:Y=0.2856X+0.1533，R2=0.9991，在1.25～10 mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

發(fā)酵前后的樣品總黃酮平均含量分別為5.08和5.29 mg/g(n=3)，可知發(fā)酵后的總黃酮含量比發(fā)酵前有所提高，這一現(xiàn)象說明，冠突散囊菌發(fā)酵葛根可以提高其總黃酮的含量。

2.2 葛根發(fā)酵前后提取物的HPLC分析

2.2.1 方法專屬性考察 供試樣品溶液和混合標準品溶液進樣測定，得到色譜圖如圖1所示。由圖1可知，特征峰明顯，與雜質(zhì)分離良好，無干擾。且經(jīng)和對照品比對，確定1、2、3號峰分別為葛根素、大豆苷、大豆苷元。

2.2.2 線性關(guān)系考察 以進樣濃度(X，mg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，得到葛根素、大豆苷、大豆苷元的回歸方程分別是Y=61809.1792X－1.0365(R2=0.99996)，Y=20385.4471X+46.4521(R2=0.99904)，Y=20683.0913X+28.7612(R2=0.99940)。結(jié)果表明，三者在0.02～0.1 mg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 方法學考察 精密度試驗:連續(xù)進樣6次，葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD值分別為0.19%、1.89%、1.86%(n=6)，表明儀器精密度基本良好。

重復性試驗:測得樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為1.80%、1.75%、1.58%(n=6)，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗:測定10 h內(nèi)樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分別為0.58%、1.95%、1.16%(n=6)，表明在10 h內(nèi)，樣品基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗:測得結(jié)果見表1，由表1可知葛根素、大豆苷、大豆苷元的平均回收率分別為100.81%、99.40%、95.56%，RSD值 分 別 為0.58%、0.61%、0.52%(n=6)。

圖1 供試品(A)和對照品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of substances(B)and sample(A)of Pueraria lobata

2.2.4 樣品含量測定 樣品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，陰性對照組DM，即用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)的冠突散囊菌樣品，未檢測到三者相應的吸收峰;而發(fā)酵前后三者含量變化顯著，發(fā)酵產(chǎn)物中葛根素和大豆苷元的含量分別是未發(fā)酵葛根的1.6倍和4.9倍，而大豆苷的含量則降低了，相比未發(fā)酵葛根其含量少了近1/2。

2.2.5 色譜比對分析 在1.2.5.1色譜條件下，對發(fā)酵前后以及陰性對照組DM的圖譜進行疊加比對分析，圖譜見圖2。由圖2可知，陰性對照組DM的圖譜中基本沒有檢測到相應的峰;而發(fā)酵組FG與未發(fā)酵組WG則檢測出較多的峰。根據(jù)圖譜差異性分析可知，在相同的進樣濃度下，經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵，葛根中的化學成分發(fā)生顯著變化，其中1～5號以及8號吸收峰經(jīng)過發(fā)酵以后強度變?nèi)?，?號、10號和11號吸收峰經(jīng)發(fā)酵則得到更強的吸收峰，其中10號吸收峰為WG組所沒有的?？梢酝茰y，葛根經(jīng)過冠突散囊菌的發(fā)酵后，通過兩者相互之間的轉(zhuǎn)化作用使得葛根或者真菌本身的代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變，從而導致了物質(zhì)成分的變化。

2.3 體外抗氧化能力測定

由圖3可知DPPH自由基的清除率隨各樣品濃度的增加而增加，尤以陽性對照組VC的清除能力最強，但當樣品濃度達到4 mg/mL時，四者對DPPH自由基的清除率能力基本持平。而當樣品濃度小于0.5 mg/mL時，發(fā)酵后的葛根FG對DPPH自由基的清除率明顯高于陰性對照組DM和未發(fā)酵葛根WG，當樣品濃度大于0.5 mg/mL時，則DM的抗氧化性略高于發(fā)酵后的葛根FG。但無論是發(fā)酵后的葛根(FG)還是陰性對照組(DM)在各個濃度下對DPPH自由基的清除率都比未發(fā)酵葛根(WG)高。四者的IC50(mg/mL)值見表3，由表3可知，四者的抗氧化活性由強到弱依次為:VC＞FG＞DM＞W(wǎng)G。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)Table 1 Results of sample recovery test(n=6)

表2 葛根樣品中各物質(zhì)含量測定結(jié)果(x±s，n=3)Table 2 Results of various substancesin P.lobata samples(x±s，n=3)

圖2 發(fā)酵組FG、未發(fā)酵組WG和陰性對照組DM的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation group FG and unfermented group WG and negative controlled substance DM

3 討論與結(jié)論

本研究基于冠突散囊菌與葛根的雙向固態(tài)發(fā)酵體系，經(jīng)HPLC指紋圖譜比對分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后葛根成分變化顯著，對其中三種異黃酮成分的含量進行測定，結(jié)果葛根素和大豆苷元含量顯著增加，而大豆苷的含量減少。此結(jié)果與施英英［33］研究結(jié)果不同，其研究結(jié)果為大豆苷元減少，而葛根素和大豆苷均增加，推測造成該現(xiàn)象的原因如下，首先使用的菌種不同，其所具有的酶系和代謝產(chǎn)物有很大差別;其次，其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中除了葛根渣外還含有30%的麩皮，而麩皮中也含有一些類黃酮物質(zhì)。

圖3 各樣品濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.3 The relationship between the concentration of each sample and the scavenging rate of DPPH radical

表3 葛根發(fā)酵前后抗氧化IC50值(n=3)Table 3 IC50 value before and after P.lobata fermentation(n=3)

通過測定發(fā)酵前后總黃酮的含量，結(jié)果顯示發(fā)酵后總黃酮含量僅略微提高;同時HPLC色譜比對發(fā)現(xiàn)DM組的發(fā)酵產(chǎn)物中不含此3種異黃酮;此外，資料表明葛根中的異黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，只在取代基或酚羥基位置有所差別［34］;由此推測導致異黃酮含量發(fā)生變化的原因很可能是葛根中異黃酮結(jié)構(gòu)類似物之間利用冠突散囊菌在代謝過程中產(chǎn)生的一系列酶發(fā)生相互轉(zhuǎn)化［35－36］，而其具體的轉(zhuǎn)化途徑還需要進一步研究。

對發(fā)酵前后葛根的抗氧化活性進行DPPH法評價分析，結(jié)果表明發(fā)酵后產(chǎn)物對DPPH自由基有一定的清除作用，具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化活性遠遠大于未經(jīng)處理的葛根，也比單純的菌種的抗氧化活性強。但是，由于在DM的色譜圖中并未檢測到葛根主要異黃酮成分相應的吸收峰，而其抗氧化活性卻遠高于未發(fā)酵的葛根，甚至接近于發(fā)酵葛根，故推測冠突散囊菌本身的代謝產(chǎn)物對抗氧化活性的改變發(fā)揮著重要作用，其作用甚至遠大于葛根異黃酮含量的提高。李瑩［37］從冠突散囊菌的大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了11個化合物，其中化合物6(Variecolorin O)和化合物7(Neoechinulin A)表現(xiàn)出較強的抗氧化活性;李玉婷等［38］研究表明冠突散囊菌中的黃色素具有優(yōu)于VE的抗氧化活性;彭曉赟等［14］從冠突散囊菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了9個化合物，其中4種苯甲醛類化合物具有很好的抗氧化作用等，這些研究結(jié)果均進一步印證了上述推測。同時，由于只采用了一種體外抗氧化活性評價方法，故不能對葛根發(fā)酵前后的抗氧化活性進行總體評價，因此論據(jù)略有不足，還需要多采用幾種評價方法，進一步驗證其體外抗氧化活性。

綜上所述，利用冠突散囊菌發(fā)酵葛根，可以提高葛根中的部分活性成分的含量，且發(fā)酵后產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。而目前對于冠突散囊菌的研究多集中在分離鑒定、命名及其化學成分的研究上，亦或是探究其對茯磚茶口感品質(zhì)的作用，而很少研究冠突散囊菌在其他方面的應用。本研究利用冠突散囊菌對中藥材葛根進行固體發(fā)酵，大大提高該菌研究潛力和價值的同時，也為葛根資源的進一步開發(fā)，甚至是中藥炮制提供一個研究思路和方向，推動中藥的現(xiàn)代化進程。