四川醬香型風(fēng)干臘腸加工貯藏特性及其“淺發(fā)酵”特征研究

王 衛(wèi)，張 旭，張佳敏，吉莉莉，康 峻，白 婷

(成都大學(xué)肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106)

腌臘肉制品是中國傳統(tǒng)肉制品的典型代表，以其濃郁風(fēng)味和易于加工貯藏等特點深受人們喜愛。四川制作腌臘肉制品的歷史悠久，臘腸、臘肉、板鴨等僅僅是作為傳統(tǒng)特色“年貨”的年加工總量預(yù)計就超過千萬噸，產(chǎn)品暢銷省內(nèi)外［1］。研究表明，臘腸屬于典型的半干水分肉制品(IMF)，其非制冷可貯性取決于加工進程中水分活度aw的快速下降對不利微生物的有效抑制［2］，而風(fēng)干或烘烤干燥伴隨的以內(nèi)源酶為主導(dǎo)的脂肪適度氧化，促進了醛類、酸類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成，同時蛋白質(zhì)的降解也會產(chǎn)生氨基酸、肽等小分子物質(zhì)，這些酶解產(chǎn)物決定了產(chǎn)品的風(fēng)味特征，并可提高臘腸的營養(yǎng)價值［3］。傳統(tǒng)風(fēng)干中式臘腸的制作工藝與西式發(fā)酵干香腸相似，但產(chǎn)品特性差異較大，西式發(fā)酵腸的產(chǎn)品特性和貯藏穩(wěn)定性主要建立于微生物作用機制上，特別是現(xiàn)代加工大多添加有乳酸菌為主導(dǎo)的微生物發(fā)酵劑，經(jīng)過外源微生物的發(fā)酵干燥而成，產(chǎn)品帶濃郁的酸香味［4］。

臘腸因不同地區(qū)配方和制作條件的差異其風(fēng)味各顯特色，四川傳統(tǒng)的醬香型風(fēng)干臘腸在產(chǎn)品特性上就與廣式臘腸和川式麻辣腸等有較大差異。團隊的前期研究顯示，醬香型風(fēng)干臘腸在aw、POV、AV、TBA、硝鹽殘留等指標(biāo)與其他臘腸和發(fā)酵香腸均存在顯著差異。特別是在微生物上，其他臘腸微生物檢出量極少，西式發(fā)酵腸乳酸菌等菌群含量很高，而風(fēng)干醬香臘腸中微生物總體比發(fā)酵腸少，但種類較豐富，在菌落總數(shù)、微球菌和乳酸菌數(shù)量上比西式發(fā)酵腸低，而酵母菌和霉菌卻含量卻較高，原因很可能是輔料中添加的微生物發(fā)酵釀造調(diào)味料，以及伴隨自然風(fēng)干進程調(diào)味料中豐富的微生物的繼續(xù)生長發(fā)揮的“淺發(fā)酵”作用所致［5］。以此為基礎(chǔ)通過原料和相關(guān)工藝開發(fā)的一種醬香風(fēng)干發(fā)酵臘腸也被命名為“淺發(fā)酵香腸”［6］，本文對其加工及貯藏不同階段理化、微生物、游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等特性的分析，以探究其可能存在的“淺發(fā)酵”機制，以及為優(yōu)化傳統(tǒng)肉制品加工工藝，提升產(chǎn)品品質(zhì)和安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬前夾肉 遂寧高金食品有限公司提供;“淺發(fā)酵”臘腸調(diào)料(四川釀造調(diào)味復(fù)合料)肉類加工四川省重點實驗室提供;氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司提供;PCA、MRS、甘露醇培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HD－3A型智能水分活度測量儀 無錫華科公司;ZFD－A5140鼓風(fēng)干燥箱 上海智城公司;Testo 205 pH計 德國儀表(深圳)有限公司;LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司;LC98IAAA型氨基酸分析儀 北京溫分分析儀器公司;5977A－7890B型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有CTC自動進樣器，PAL3)美國安捷倫公司;BFJX－500智能調(diào)控風(fēng)干發(fā)酵裝置 嘉興艾博食品機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臘腸制作工藝 a.原輔料為豬瘦肉65%，豬肥膘肉30%，“淺發(fā)酵”臘腸專用調(diào)料5%。豬瘦肉絞制，肥膘切丁。

b.豬瘦肉和肥丁與調(diào)料在真空攪拌機內(nèi)混合，在4℃冷庫腌制1 d，用真空灌腸機灌入豬小腸腸衣。清洗凈外表，室內(nèi)掛晾晾干表面水汽。

c.掛入智能調(diào)控風(fēng)干發(fā)酵裝置中，采用12 h的高低溫度、濕度和氣流切換法，即溫度6～7℃、相對濕度65%～70%、風(fēng)速0.8～0.9 m/s，風(fēng)干12 h，然后溫度11～12℃、相對濕度70%～75%、風(fēng)速1.1～1.2 m/s風(fēng)干12 h。風(fēng)干9～10 d至含水量29%～30%，水分活度aw0.79～0.80。

d.風(fēng)干后臘腸在15℃室內(nèi)掛晾12～24 h，真空包裝后在低于20℃室內(nèi)成熟與貯藏30 d。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 p H 使用肉類專用插入式pH計插入腸體進行測定。

1.2.2.2 水分含量 參照GB 5009.3－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中直接干燥法測定。

1.2.2.3 水分活度(aw)將均質(zhì)后的樣品于樣品皿中鋪平，高度為樣品皿2/3左右，放入水分活度儀中，10 min后儀器自動記錄水分活度響應(yīng)值。

1.2.2.4 微生物測定 參照余靜等［7］的方法，菌落總數(shù)選用PCA平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，乳酸菌選用MRS乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基，微球菌用高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基測定。

1.2.2.5 游離氨基酸測定 樣品前處理:參照GB 5009.124－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》對樣品進行前處理，肉樣切碎后用勻漿機拍打均勻后密封冷凍保存，分析時解凍分析。稱取肉樣(很難獲得高均勻度的樣品)3～5 g于水解管中，加入15 mL 6 mol/L鹽酸溶液，混勻后冷凍5 min后密封，放入110℃烘箱中水解22 h后取出冷卻至室溫，水解液過濾至50 mL比色管中(用少量水多次沖洗)，定容至50 mL，混勻。吸取1 mL濾液于100 mL尖底濃縮瓶，于旋蒸上減壓干燥(45℃)，干燥殘留物用1 mL水溶解后再減壓干燥，蒸干;加入1 mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻后通過0.22μm水相濾膜，轉(zhuǎn)移至進樣瓶的濾液為待測液，供儀器測定用。

樣品測定:待測液根據(jù)儀器使用條件和梯度程序進行測定，采用面積外標(biāo)法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

1.2.2.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定 前處理條件［8］:取3 g粉碎后的樣品于15 mL頂空瓶中密封，設(shè)置CTC自動進樣器對樣品的前處理條件如下:加熱箱溫度75℃，加熱時間45 min，樣品抽取時間20 min，解析時間5 min。

GC－MS條件:HP－5MS UI色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);壓力32.0 kPa;流速1.0 mL/min;載氣為He氣，不分流進樣;進樣口溫度250℃;升溫程序:起始溫度40℃，保持1 min，以3℃/min升至85℃，保持3 min，再以3℃/min升至105℃，保持2 min，再以12℃/min升至165℃，再以10℃/min升至230℃。電子電離源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃;檢測器電壓350 V;質(zhì)量掃描范圍(m/z):40～500。

定性和定量:對化合物進行分析時，將得到的數(shù)據(jù)在儀器的NIST 14.L譜庫中進行檢索和匹配，選擇匹配度高于80%的物質(zhì)。對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化定量，得出各組分的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試樣取腌制前(0 d)，腌制后(1 d)，風(fēng)干發(fā)酵階段(3、6、9 d)，以及真空包裝后成熟及貯藏15和30 d(加工期總第24和39 d)。采用SPSS 24.0進行單因素方差分析(Duncan法)，Origin 2018進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工及貯藏過程中p H、水分含量和aw的變化

臘腸加工及貯藏期p H、水分含量、aw變化見表1。腌制前肉料p H為6.30，風(fēng)干真空包裝前降至5.79，貯藏15 d時為5.70，30 d時5.68。水分含量由初始43.33%降至風(fēng)干結(jié)束(9 d)的30.12%，包裝后成熟及貯藏至15和30 d時變化顯著，分別為29.73%和29.81%。aw在風(fēng)干6 d后迅速降低至0.808，至9 d為0.794，之后趨于穩(wěn)定。顯然p H、水分含量和aw在加工期均快速下降，在此后的成熟和貯藏期趨于穩(wěn)定。根據(jù)對廣式臘腸的研究，加工進程pH從最初的6.0降至5.8左右，產(chǎn)品pH大致在5.7～5.9;而西式發(fā)酵腸加工進程在p H可降至4.5甚至更低，pH根據(jù)產(chǎn)品類型可在4.4～4.9［9－10］。本試驗臘腸pH的下降度顯然比常規(guī)的臘腸幅度高，又比西式發(fā)酵腸的低。在此類風(fēng)干發(fā)酵產(chǎn)品中，當(dāng)水分活度降至低于0.8，微生物發(fā)酵將受到抑制，這也是保證臘腸微生物穩(wěn)定性的關(guān)鍵［11］。

2.2 加工及貯藏過程中微生物的變化

臘腸微生物特性變化見表2。隨著加工貯藏時間的延長菌落總數(shù)逐步有所增加，加工初期為2.09×105CFU/g，風(fēng) 干 后 包 裝 前 增 加 至4.17×107CFU/g，貯藏15 d略有下降，然后保持穩(wěn)定。乳酸菌群則先上升然后逐步有所下降，加工初期為1.58×104CFU/g，至發(fā)酵風(fēng)干的第6 d達到7.76×105CFU/g的最高值，包裝貯藏15 d及以后降至1.15×105CFU/g并在此后一直略有下降，隨著肉餡水分活度aw的降低及微球菌等菌群的增加顯然對其產(chǎn)生了一定的抑制作用。微球菌的變化則表現(xiàn)為兩階段，在9 d的發(fā)酵風(fēng)干期從8×103CFU/g增加至8.3×104CFU/g，此后緩慢增加至1.5×105CFU/g后保持穩(wěn)定。

四川醬香型風(fēng)干臘腸特性有別于其他中式臘腸和西式發(fā)酵腸，其機制一是添加的四川釀造調(diào)味品提供的豐富微生物菌群，可能在風(fēng)干進程中發(fā)揮了一定的微生物發(fā)酵作用，二是較短的風(fēng)干時間，水分活度aw快速降低，又抑制了微生物進一步發(fā)酵。產(chǎn)品風(fēng)味的形成則很可能是輔料中釀造發(fā)酵調(diào)料的風(fēng)味物，微生物發(fā)酵以及內(nèi)源酶對脂肪的氧化和蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)生的風(fēng)味物等的共同作用［5］，而微生物發(fā)酵促進風(fēng)味形成機制中微球菌類菌群發(fā)揮的作用特別顯著［12－13］，本實驗結(jié)果微球菌呈現(xiàn)的優(yōu)勢菌群特征予以了印證，對此有必要進一步深入探究。

2.3 加工及貯藏過程中游離氨基酸的變化

蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的游離氨基酸是臘腸滋味物質(zhì)的主要來源［14］。本試驗醬香型臘腸加工及貯藏過程中游離氨基酸的變化見表3。隨風(fēng)干發(fā)酵時間延長，臘腸中游離氨基酸總量(TAA)、必需氨基酸(EAA)及鮮味氨基酸(DAA)遞增。在風(fēng)干發(fā)酵至第9 d時，產(chǎn)品中游離氨基酸總量達661.33 mg/100 g，在包裝貯藏階段仍有所增加，至30 d達766.74 mg/100 g，此時EAA和DAA分別為260.92和316.33 mg/100 g，占TAA的41.26%和34.03%。其中的谷氨酸在香腸加工貯藏過程中含量相對較高，且一直在持續(xù)增加。作為谷氨酰胺分解代謝物，谷氨酸賦予產(chǎn)品特殊的鮮味;精氨酸、苯丙氨酸分別在風(fēng)干第6和9 d時達到最高值，甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、異亮氨酸在貯藏30 d達到最大值。對西式薩拉米發(fā)酵腸的研究結(jié)果，在其風(fēng)干成熟過程中，大分子蛋白質(zhì)不斷降解，由于肽酶作用這些游離氨基酸從氨基末端水解并積累并在此階段占主導(dǎo)［15］，游離氨基酸不僅是作為產(chǎn)品重要的呈味物，還可以不斷通過Strecker降解或Maillard反應(yīng)形成相關(guān)揮發(fā)性風(fēng)味物，并作為揮發(fā)性風(fēng)味化合物的重要前體物質(zhì)［16］。本實驗結(jié)果也反映出，即使在風(fēng)干發(fā)酵結(jié)束，臘腸包裝后在較低溫下成熟和貯藏，仍然伴隨有一定的“后發(fā)酵”作用，可通過影響氨基酸和必需氨基酸的變化而有利于風(fēng)味的進一步改善［17］。

表1 臘腸加工及貯藏pH、水分含量和aw的變化Table 1 Change of pH，water content and aw of sausage

表2 臘腸加工及貯藏過程中微生物的變化Table 2 Changes of microorganisms during processing and storage

表3 臘腸加工及貯藏過程中游離氨基酸的變化(mg/100 g)Table 3 Changes of free amino acids during processing and storage(mg/100 g)

2.4 加工及貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

利用固相微萃?。瓪庀嗌V－質(zhì)譜聯(lián)用儀(SPME－GC－MS)分析臘腸中揮發(fā)性風(fēng)味成分，檢測結(jié)果和主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其相對含量見表4和表5。香腸在加工貯藏過程中共鑒定出59種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類3種、醇類10種、醛類7種、酯類7種、酮類3種、烯烴類20種、烷烴類5種、其他類4種，貯藏30 d時其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量最高，分別為40種和93.6%。在香腸風(fēng)干發(fā)酵及貯藏期間，烯烴類化合物占比最大，其中風(fēng)干3 d時達到59.74%，其次是酯類和醇類，但不同風(fēng)干、成熟及貯藏時的產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味成分、物質(zhì)種類及含量存在差異。

酸類化合物加工及貯藏階段均變化不大，相對含量在風(fēng)干發(fā)酵結(jié)束時最高，為8%左右，貯藏階段下降。該類化合物可通過脂質(zhì)降解、脫氨作用或微生物代謝產(chǎn)生。醬香臘腸在加工過程中，由于釀造調(diào)味品調(diào)料中微生物的作用，因此存在一定程度的發(fā)酵［5］，且微生物對碳水化合物的代謝可以影響酸類物質(zhì)的形成［18］，同時脂肪與氨基酸作用生成了酸類物質(zhì)，可發(fā)現(xiàn)加工開始后產(chǎn)品中均含有己酸，己酸不僅可抑制有害微生物的生長繁殖，還能賦予臘腸特殊的風(fēng)味。此外，隨貯藏時間增加，酸類物質(zhì)對酯類化合物的生成也有一定貢獻作用，但在此淺發(fā)酵香腸中的作用顯然有限。

醇類化合物中飽和醇閾值較高，產(chǎn)品風(fēng)味貢獻低，飽和醇則對肉品風(fēng)味影響顯著，但總體而言，醇類物質(zhì)對香腸風(fēng)味無較大貢獻，一般源于脂肪氧化分解，以及碳水化合物被微生物降解所得［19］。本試驗中醇類化合物在1 d即加入調(diào)料后達到最大值10.36%，之后的加工貯藏期變化不大。但0 d時的1－辛烯－3－醇在加入調(diào)味料之后一直未檢出，說明該物質(zhì)主要來源于原料肉，在不飽和醇中最富代表性，具有明顯蘑菇芳香味，對臘腸的肉質(zhì)的風(fēng)味具有改善作用［20］。

原料肉中檢出酸、酮和酯類等物質(zhì)都很低，含量最高的是醛類物質(zhì)，醛類通常被認為是香腸的重要成分［21］。本實驗中0 d檢出醛類6種，相對含量為13.9%，風(fēng)干過程中一直未檢出，至貯藏30 d檢出3種，相對含量為1.58%。隨著調(diào)味料中閾值較高的烯烴和酯類物質(zhì)的增加，影響了肉品本身特有香氣——醛類的檢出，說明臘腸的主要風(fēng)味成分還與調(diào)味料密切相關(guān)，如本試驗產(chǎn)品添加的郫縣豆瓣中的酯類［22］和香辛料中的烯類物質(zhì)［23］。

隨加工及貯藏進程，臘腸總酯類物質(zhì)逐步增加。該類物質(zhì)主要由脂質(zhì)代謝或醇類與酸類化合物經(jīng)酯化反應(yīng)產(chǎn)生［24］，是臘腸發(fā)酵生產(chǎn)中風(fēng)味形成的必然物質(zhì)［25－26］。本實驗中臘腸酯類多為乙酯類化合物，短鏈酸生成的酯類可賦予產(chǎn)品香甜風(fēng)味，如己酸乙酯富有果香味，辛酸乙酯則具有酒香氣息。乙酸芳樟酯具有檸檬、薰衣草幽香氣味［27］，各組產(chǎn)品中乙酸芳樟酯含量皆最高，且遠高于其他酯類含量。包裝后成熟及貯藏至39 d產(chǎn)品中酯類物質(zhì)數(shù)量和相對比例均達到最高值，為6種和23.73%，這與王海燕等［28］研究自然發(fā)酵香腸中酯類為25.32%相似。

表4 淺發(fā)酵香腸加工貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Table 4 Changes of volatile flavor substances during processing and storage

續(xù)表

表5 臘腸中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其相對含量Table 5 Relative content of main volatile flavor components

酮類物質(zhì)具奶油、果香味特征，一般由脂質(zhì)氧化降解或Maillard反應(yīng)生成，對肉制品風(fēng)味有一定貢獻作用［29］，其閾值也低。本試驗臘腸成熟及貯藏至39 d的酮類含量最高，顯然是隨后發(fā)酵和貯藏時間延長，脂類進一步氧化分解而得，但其含量和比較均很低，發(fā)揮的作用不大。

烴類化合物一般包括烷烴類、烯烴類及芳香烴類物質(zhì)，其閾值高，大多香氣偏弱甚至無味。本試驗顯示烷烴僅在原料肉中存在，此后未檢出，成品中含量也甚微。而烯烴類化合物數(shù)量多達18種，相對含量均較高，在風(fēng)干發(fā)酵第3 d為59.74%，貯藏后成品中55.07%。但此類物質(zhì)對產(chǎn)品風(fēng)味的影響較小，更多的是對臘腸風(fēng)味起協(xié)調(diào)作用［30］。D－檸檬烯、茴香烯、石竹烯屬萜類物質(zhì)，在烴類化合物中含量較高，各組產(chǎn)品中最高可占到揮發(fā)性成分的41.65%，可能主要源于所添加的四川發(fā)酵釀造調(diào)料［31］。

3 結(jié)論

以富含有益微生物的四川釀造調(diào)料為輔料，借助于智能調(diào)控風(fēng)干發(fā)酵裝置，模擬四川傳統(tǒng)風(fēng)干臘腸氣候風(fēng)干條件制作四川醬香型臘腸。對其特性指標(biāo)的測定表明，隨加工及貯藏進程，pH、水分含量和aw值逐步下降，在此后的成熟和貯藏期趨于穩(wěn)定，其中pH的下降度比常規(guī)的臘腸下降度高，又比西式發(fā)酵腸下降度低。菌落總數(shù)則逐步有所增加，然后逐趨于穩(wěn)定，而乳酸菌群則先上升然后逐步有所下降。微球菌的變化表現(xiàn)為兩階段，風(fēng)干發(fā)酵期增加至接近104CFU/g，此后緩慢增長至105CFU/g并保持穩(wěn)定。隨風(fēng)干時間延長，臘腸中游離氨基酸總量(TAA)、必需氨基酸(EAA)及鮮味氨基酸(DAA)遞增。揮發(fā)性風(fēng)味成分測定顯示，臘腸在加工貯藏過程中共鑒定出59種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的存在，貯藏30 d后其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量最高，烯烴類化合物占比最大，其次是酯類和醇類，而不同風(fēng)干及貯藏階段的產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味成分、物質(zhì)種類及含量存在差異。但即使在風(fēng)干發(fā)酵結(jié)束，臘腸包裝后在較低溫下成熟和貯藏，其微微生物、風(fēng)味成分等的變化也顯示其仍然伴隨有一定的“后發(fā)酵”作用，對此有必要對其可能的淺發(fā)酵機制進一步深入探究。