內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族兒童MPO基因與川崎病相關(guān)性研究

肖 蓉 常 鑫 陳麗清

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱(chēng)皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，病因尚不明確，亞洲地區(qū)多見(jiàn)，好發(fā)于5歲以下人群。病變較為嚴(yán)重的是CAL，且兒童時(shí)期發(fā)生的冠狀動(dòng)脈損害(CAL)可增加成年早期發(fā)生心肌缺血、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)，因此KD所致CAL是目前臨床治療非常棘手的問(wèn)題[1,2]。近年來(lái)，隨著KD發(fā)生率的上升，國(guó)內(nèi)外各地流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)均發(fā)現(xiàn)，KD的發(fā)生、發(fā)展，尤其是合并CAL，與其遺傳性及地區(qū)特異性有著較為密切的聯(lián)系。在遺傳性方面研究發(fā)現(xiàn)MPO基因不同位點(diǎn)基因多態(tài)性的表達(dá)對(duì)MPO酶活性有影響，其中MPO基因(-463G>A, rs2333227)的相關(guān)性較為顯著[3]。因其具有地區(qū)特異性，熊志等[4]和趙宗秀等[5]進(jìn)一步對(duì)大陸人群的MPO基因(-463G>A, rs2333227)展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)MPO基因的表達(dá)與KD易感性及KD并發(fā)CAL可能存在較為顯著的相關(guān)性。通過(guò)以上研究分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因與KD易感性的顯著相關(guān)性，而MPO基因(-463G>A, rs2333227)的發(fā)現(xiàn)，為KD并發(fā)CAL的病因方面提供了遺傳分子學(xué)數(shù)據(jù)。近幾年我國(guó)大陸內(nèi)地對(duì)MPO基因與KD易感性及KD并發(fā)CAL的報(bào)道較為罕見(jiàn)，而探討蒙古族KD兒童基因方面的病因與該基因更是缺乏。本項(xiàng)研究通過(guò)提取研究對(duì)象血標(biāo)本中的MPO基因rs2333227位點(diǎn)，探討在內(nèi)蒙古地區(qū)的蒙古族KD兒童的該基因位點(diǎn)與KD易感性、KD并發(fā)CAL以及KD的典型臨床特點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性，并為KD的病因?qū)W方面提供最新研究數(shù)據(jù)。

資料與方法

1.研究對(duì)象:選取2016年1月～2020年6月在內(nèi)蒙古自治區(qū)兒童醫(yī)院確診的KD 100例蒙古族患兒為病例組。在相同時(shí)期選擇100例在內(nèi)蒙古自治區(qū)兒童醫(yī)院兒?？平】刁w檢的蒙古族兒童為對(duì)照組(均排除心、肺、肝、腎及血液系統(tǒng)疾病)。病例組通過(guò)心臟超聲提示有無(wú)累及冠狀動(dòng)脈，將KD患兒歸為CAL組，NCAL組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)KD患兒：①年齡6月～5歲蒙古族兒童；②符合美國(guó)心臟協(xié)會(huì)發(fā)表2017年修訂的川崎病科學(xué)聲明的典型KD患兒[6]；③排除猩紅熱、葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征、藥物過(guò)敏等疾病。(2)對(duì)照組：①年齡 6個(gè)月～7歲蒙古族兒童；②經(jīng)體檢未發(fā)現(xiàn)異常的兒童，排除了各系統(tǒng)的疾病。本研究取得內(nèi)蒙古自治區(qū)兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)準(zhǔn)許，并得到所有入組對(duì)象監(jiān)護(hù)人的知情同意。所有入選對(duì)象均為祖籍三代居住在內(nèi)蒙古地區(qū)、無(wú)血緣關(guān)系、無(wú)異族通婚史的蒙古族兒童。

2.方法：(1)收集KD患兒病初的臨床資料，包括年齡、性別、典型KD癥狀，以及血常規(guī)、血小板、紅細(xì)胞沉降率、N端腦鈉肽結(jié)果。(2)對(duì)兩組血液標(biāo)本分別標(biāo)記(病例組 A1-A50，對(duì)照組 D1-D50)，記錄相關(guān)資料，使用華大基因公司試劑提取盒提取基因，并完成直接基因測(cè)序：上游引物為：5′-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3′，下游引物為：5′-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3′。PCR總反應(yīng)體系50μl，含有10倍PCR反應(yīng)緩沖液5μl，dNTP混合液4μl，引物各1μl，Ex公司 Taq酶0.25μl；測(cè)序反應(yīng)體系為：2μl Mix(Bigdye3.1、5×sequencing buffer、H2O)，2μl純化后的PCR 產(chǎn)物，1μl引物(5mmol/L)。

結(jié) 果

1.一般情況:100例病例組中，男性60例，女性40例，患者平均年齡1.80±1.26歲；對(duì)照組100例兒童中，男性54例，女性46例，平均年齡1.78±1.33歲，兩組組間年齡和性別比例分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；KD中有CAL組48例，男性28例，女性20例，平均年齡1.80±1.23歲；NCAL組中男性32例，女性20例，平均年齡為1.79±1.32歲。病例組、對(duì)照組兩組在年齡、性別間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CAL組、NCAL組兩組在年齡、性別間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：MPO基因 rs2333227位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段長(zhǎng)度是665bp。以 Marker為參照標(biāo)準(zhǔn)，ddH2O為空白對(duì)照，圖1PCR產(chǎn)物于600～700bp間的條帶熒光度最適，且周?chē)鸁o(wú)其余非目的性條帶存在，故提示該基因PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物濃度及純度已達(dá)到目標(biāo)。

圖1 病例組與對(duì)照組MPO基因rs2333227位點(diǎn)基因型

3.MPO基因SNP位點(diǎn)基因型的確定及頻率分布:病例組和對(duì)照組MPO基因rs2333227位點(diǎn)GG、GA和AA基因型頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.392，P=0.302)，等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.592，P=0.351)，詳見(jiàn)表1。與GG基因型比較，GA和AA基因型與KD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(OR=0.64, 95%CI: 0.25～1.63，P=0.351)詳見(jiàn)表2。

表1 病例組和對(duì)照組MPO基因的等位基因頻率[n(%)]

表2 病例組和對(duì)照組MPO基因的相關(guān)性分析[n(%)]

4.CAL組和NCAL組MPO基因 rs2333227位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布：KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點(diǎn)GG、GA和AA基因型頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.263，P=0.044)，等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.037，P=0.045)，詳見(jiàn)表3。與GA和AA基因型比較，GG基因型增加CAL的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63，P=0.026)，詳見(jiàn)表4。

表3 冠脈損害(CAL)組和非冠脈損害(NCAL)組的MPO基因等位基因頻率[n(%)]

表4 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點(diǎn)的相關(guān)性分析[n(%)]

5.KD中基因多態(tài)性與臨床特征的相關(guān)性:MPO基因rs2333227多態(tài)性與KD臨床特征的相關(guān)性分析結(jié)果表明，皮疹、唇及口腔表現(xiàn)、手足癥狀、球結(jié)膜充血、淋巴結(jié)腫大、WBC、中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞沉降率、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表5。

表5 MPO基因多態(tài)性與KD臨床特征的相關(guān)性分析

討 論

KD以6個(gè)月～5歲患兒為多發(fā)年齡段，是一種急性全身性中小血管炎性疾病，約30% KD患兒在病程中尤其是急性期時(shí)可發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，而冠狀動(dòng)脈瘤的形成及破裂是KD患兒死亡的最重要原因[7,8]。目前國(guó)內(nèi)外研究表明，KD并發(fā)CAL的高危因素主要包括患兒年齡及性別、合并感染程度、較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的發(fā)熱、實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)以及遺傳基因等，故遺傳因素的影響不容忽視[9,10]。MPO是過(guò)氧化物酶亞家族的成員，一種可以調(diào)控自身免疫及炎性反應(yīng)的血紅蛋白，對(duì)早期預(yù)警心血管疾病起著密切作用，是血管性炎癥的重要生物學(xué)標(biāo)志物之一，存在于胞質(zhì)與膜相結(jié)合的天青顆粒中，由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性和免疫細(xì)胞分泌，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，激活的炎性、免疫細(xì)胞迅速釋放MPO，而MPO中的顆粒以脫顆粒形式或胞吐作用分泌到細(xì)胞外間隙中，催化過(guò)氧化氫與氯離子生成次氯酸，產(chǎn)生一系列的具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的活性氧，并導(dǎo)致氧化過(guò)激，導(dǎo)致免疫功能紊亂，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，其中冠狀動(dòng)脈的損傷較為多見(jiàn)[11]。因此MPO的任何異常表達(dá)和釋放都可能加重炎癥和組織的損傷[12～14]。有研究發(fā)現(xiàn)KD患兒的機(jī)體內(nèi)存在過(guò)量氧化物，并可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激，進(jìn)而推測(cè)MPO基因與KD的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)性[15]。因此，MPO基因可能是KD發(fā)病過(guò)程中潛在的關(guān)鍵因素。

在MPO與KD的相關(guān)性方面，本研究對(duì)象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，且達(dá)到了遺傳平衡，具有群體代表性，并在血液中均檢測(cè)到MPO基因rs2333227 位點(diǎn)，存在GG、GA、AA型3種基因型，這與我國(guó)報(bào)道文獻(xiàn)相同。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，該基因的等位基因頻率在病例組與對(duì)照組的分布中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.592，P=0.351)，3種基因型的頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.392，P=0.302)，提示該基因位點(diǎn)與KD易感性無(wú)顯著相關(guān)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果有差異，考慮與種族、地域及遺傳易感性相關(guān)，今后需進(jìn)一步加大樣本量開(kāi)展深入研究[3～5]。

在MPO與KD臨床特點(diǎn)方面，目前大多數(shù)醫(yī)院對(duì)KD的診斷多以典型癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果超聲心動(dòng)圖結(jié)果為主要診斷方法。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，KD典型臨床表現(xiàn)(如皮疹、唇及口腔表現(xiàn)、手足癥狀、球結(jié)膜充血、淋巴結(jié)腫大)與MPO 基因 rs2333227 位點(diǎn)的各基因型無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而熊志等[4]在該基因位點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)攜帶有GG基因型的患兒發(fā)生手足水腫、腹腔積液的比例較其他基因型患兒高，與本研究結(jié)果不同，考慮與樣本量少及地區(qū)差異有關(guān)。

在實(shí)驗(yàn)室檢查方面與KD關(guān)系密切且研究較多的是WBC、中性粒細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞沉降率、CRP及BNP，本研究中該基因位點(diǎn)與以上實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；這與彭宇等[16]、張娟等[17]研究結(jié)果相同，且對(duì)于大部分KD患兒的WBC、血小板計(jì)數(shù)、CRP、BNP和紅細(xì)胞沉降率是升高為主要表現(xiàn)。

在本研究中，MPO與KD并發(fā)CAL的研究結(jié)果是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出MPO 基因 rs2333227 位點(diǎn)在CAL組和NCAL組中的3種基因型頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.263，P=0.044)，故認(rèn)為該基因位點(diǎn)與KD并發(fā)CAL可能有相關(guān)性；在兩組該基因位點(diǎn)的等位基因頻率分布的研究方面，其分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.037，P=0.045)，還發(fā)現(xiàn)GG基因型增加KD并發(fā)CAL的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63)，進(jìn)而推測(cè)該基因位點(diǎn)G等位基因可能增加KD并發(fā)CAL的風(fēng)險(xiǎn)；這與以往研究結(jié)果相同，該研究中與G等位基因比較，攜帶A等位基因的患者對(duì)KD的保護(hù)作用增加了1.37倍(OR=0.73，95%CI:0.54～0.98，P=0.033)。本研究該基因位點(diǎn)中A等位基因頻率在病例組、對(duì)照組中及CAL組及NCAL組中的分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且國(guó)外報(bào)道推測(cè)MPO-463G>A(rs2333227)的A等位基因頻率在不同種族存在一定不同，如在歐洲人群中為22.8%，在亞洲人群中約為14.7%，結(jié)合本研究對(duì)象均為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族兒童，且樣本量不足，故對(duì)此結(jié)果仍須進(jìn)一步完善及研究[18～20]。

目前已有多種基因被研究者發(fā)現(xiàn)與KD的易感性及并發(fā)CAL呈相關(guān)性，但關(guān)于單一致病基因?qū)膊“l(fā)生影響的相關(guān)研究較少，結(jié)合此次研究樣本例數(shù)少，實(shí)驗(yàn)條件較為局限性，各種與氧化應(yīng)激有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物和中性粒細(xì)胞活化也未得到評(píng)估，且KD本身存在地區(qū)差異，MPO基因SNP rs2333227位點(diǎn)與KD的發(fā)生及KD并發(fā)CALs的確切關(guān)系尚需開(kāi)展大樣本量、多中心的研究予以證實(shí)。