結直腸癌MMR蛋白和MSI檢測對比及臨床病理特征分析

孫林雍 王紫靜 唐 源 陳 昶 江 丹

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來 CRC發(fā)生率及病死率呈逐年上升趨勢[1]。科學、規(guī)范的治療對患者的預后至關重要，分子檢測結果對臨床制訂治療方案非常重要。各類指南均推薦應用免疫組化(IHC)法檢測MMR蛋白表達及PCR法檢測MSI位點。錯配修復蛋白表達缺失(dMMR)和高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)對CRC患者的預后判斷、藥物療效預測和Lynch綜合征篩查有明確的指導意義[2，3]。Ⅱ期CRC患者如有MSI-H提示預后較好，但可能無法從氟尿嘧啶類單藥輔助治療中獲益[4]。dMMR或MSI-H分子表型轉移性結直腸癌的患者能從免疫治療中獲益[5]。因此，MSI檢測或MMR狀態(tài)是CRC目前最佳的療效預測指標。IHC法具有操作簡單、快捷、經濟的特點，還可以對活檢小標本進行檢測，但IHC染色結果受組織固定、預處理、抗體克隆號不同等多種因素的影響。用PCR法檢測腫瘤MSI狀態(tài)，有研究者提出了一組5個單核苷酸重復序列BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR22或NR27，具有較高的敏感度和特異性。這5個位點包含在本實驗檢測的6個單核苷酸位點(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和MONO-27)中，有證據顯示增加單核苷酸標志物可以提高MSI檢測敏感度、特異性[6]。本實驗旨在探討CRC中MMR/MSI的發(fā)生狀況與臨床病理特征的相關性，以及指導個體化治療中的作用，為臨床病理診斷及預后評價提供更為完善的參考價值。

資料與方法

1.一般資料：收集2012年1月～2019年5月筆者醫(yī)院診斷為CRC并已行MSI檢測患者樣本392例作為研究對象，其中，男性236例，女性156例?；颊吣挲g16～85歲，中位年齡48.0歲。左半結腸138例、右半結腸122例、直腸132例。所有患者臨床病理資料完整，均經手術治療，有明確的病理診斷結果，選取樣本中腫瘤占比>50%的蠟塊和癌旁正常組織蠟塊。

2.儀器與試劑：ABI 3730xl型遺傳分析儀、Nanodrop2000微量核酸測定儀、LEICA BOND-MAX(徠卡全自動IHC染色儀)。石蠟包埋組織(FFPE)樣本DNA提取試劑盒(56404，美國Qiagen公司)、MSI試劑盒(中國閱微基因公司)、一抗MLH1單克隆抗體(1∶50，克隆號：ES05)、MSH2單克隆抗體(1∶50，克隆號：RED2)、MSH6單克隆抗體(1∶50，克隆號：EP49)、PMS2單克隆抗體(1∶50，克隆號：EP51)均購自北京中杉金橋生物公司。第二抗體購自LEICA公司全自動IHC染色儀配套試劑盒。

3.DNA提?。簩FPE切成4μm厚薄片，取3～5張裝入EP管中用于DNA的提取。按照QIAamp(Cat.56404)DNA FFPE Tissue Kit(50T)試劑盒說明書進行。使用Nanodrop2000測定DNA濃度，A260/A280為1.8～2.0。

4.IHC及結果判讀：選取FFPE切取4μm厚的白片，65℃，烤片1h。直接使用LEICA BOND-MAX全自動IHC染色儀(徠卡公司)，染色程序參照廠家試劑盒說明書進行。4種抗體均為核著色，以淋巴細胞作為陽性內對照，腫瘤細胞核著色判讀為陽性，無著色判讀為陰性(圖1)。4種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2)中至少1種蛋白缺失判定為dMMR；全部陽性判定為錯配修復蛋白完整(pMMR)。

圖1 錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2在結直腸癌中的表達(EnVision，×40)

5.MSI檢測及結果判讀：分別對腫瘤組織及癌旁正常組織進行DNA提取，取適量DNA在ABI 3730xl型遺傳分析儀上，運用多重熒光PCR-毛細管電泳技術，采用MSI試劑盒對6個單核苷酸重復位點(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和MONO-27)和Penta C、PentaD和Amelogenin位點進行檢測。并且利用GeneMapper v3.2對檢測數據進行分析。至少2個單核苷酸重復位點發(fā)生改變，歸納為MSI-H(圖2)。僅有1個單核苷酸重復位點發(fā)生改變，歸納為低度MSI(MSI-L)。未發(fā)生改變，歸納為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。

圖2 PCR法檢測MSI表型顯示MSI-H

6.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計分析，定性資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行顯著性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.MSI檢測及與臨床病理相關性：392例CRC中，71例為MSI-H，4例為MSI-L，317例為MSS。MSI-H組與MSS/MSI-L組比較，在發(fā)病年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、組織學類型、臨床分期及淋巴結轉移等方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在患者性別、分化程度、浸潤深度等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

2.MMR蛋白檢測及與臨床病理相關性：392例CRC IHC染色病例中，dMMR組74例，缺失率為18.9%；pMMR組318例，陽性率為81.1%。dMMR組與pMMR組比較，在發(fā)病年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、組織學類型、臨床分期及淋巴結轉移等方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在患者性別、分化程度、浸潤深度等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。MLH1、MSH2、MSH6及PMS2蛋白的表達情況詳見表2。

表1 MMR/MSI與結直腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

表2 MMR蛋白在結直腸癌中的表達

3.IHC與PCR法檢測結果分析：392例CRC病例中，以PCR檢測結果為標準，IHC的敏感度和特異性分別為97.2%和98.4%，以IHC檢測結果為標準，PCR檢測結果的敏感度和特異性分別為93.2%和99.4%，IHC檢測MMR蛋白與PCR法檢測MSI一致性為98.2%(表3)。

表3 IHC法檢測MMR蛋白與PCR檢測MSI一致性分析(n)

4.檢測結果不一致病例分析：7例檢測不一致的樣本中，4例為男性，3例為女性；左半結腸5例，右半結腸2例；4例為腺癌，3例為黏液腺癌；2例PCR法檢測結果為MSI-H，IHC法檢測結果為pMMR；5例PCR法檢測結果為MSS，IHC法檢測結果為dMMR(表4)。

表4 IHC檢測MMR蛋白與PCR檢測MSI結果不一致情況(n)

討 論

本研究中dMMR為18.9%(74/392)，MSI-H占18.1%(71/392)。李惠等[7]研究顯示dMMR為14.7%。一項研究顯示西方國家dMMR可達15%～20%，與本實驗一致[8]。筆者醫(yī)院地處西南，患者多來自多民族聚集區(qū)，dMMR可能與種族有關。文獻報道MSI檢出率為15%～19%，本組實驗結果與文獻基本一致，但低于劉超等[9]的研究，分析原因主要為納入研究的病例臨床分期不同導致的，劉超等[9]僅選擇Ⅱ期和Ⅳ期結腸癌患者，而本組選取病例為Ⅰ～Ⅳ期結直腸癌患者。

本實驗中MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的缺失率分別為12.5%、3.1%、15.1%和3.8%，即MLH1及PMS2缺失最為常見，與多數研究結果一致[10,11]。本實驗結果顯示，在342例MLH1陽性病例中，PMS2陽性332例；49例MLH1缺失病例中，PMS2缺失49例，380例MSH2陽性病例中，MSH6陽性376例；12例MSH2缺失病例中，MSH6缺失12例，說明MLH1與PMS2、MSH2與MSH6常協(xié)同表達或缺失，與多數研究結果一致[11,12]。MSH6和PMS2單獨缺失分別為4例和10例。一般情況下MLH1蛋白的表達缺失同時伴有PMS2蛋白的表達缺失；MSH2蛋白的表達缺失同時伴有MSH6蛋白的表達缺失。PMS2或MSH6蛋白表達缺失可能不會導致MLH1和MSH2蛋白表達缺失。這種機制對本實驗結果也是一種很好的解釋。然而本實驗中檢測到1例MLH1與MSH6同時缺失的病例，重新閱片后發(fā)現(xiàn)MLH1切片內對照陽性很弱，重復檢測后判讀為pMMR。Mangold等[13]報道MSI腫瘤可表現(xiàn)為腫瘤細胞核表達明顯弱于內對照細胞，或IHC染色存在異質性，說明有經驗的病理醫(yī)生在評估MMR蛋白與技術質量控制在結果判讀中的重要性。

對比IHC法檢測MMR蛋白與PCR法檢測MSI的結果及其臨床病理相關性，本實驗顯示兩者的敏感度與特異性均在93%以上，一致性高達98.2%。IHC的敏感度高于PCR法，相反PCR法的特異性高于IHC。與大多數報道的結果一致[14,15]。說明檢測MMR蛋白表達情況可有效地反映腫瘤MSI狀態(tài)。Shia等[16]比較活檢小組織與手術切除組織IHC染色結果顯示兩者具有高度的一致性，提示IHC法檢測活檢小組織MMR蛋白對預測腫瘤MSI狀態(tài)具有一定的參考價值。

7例檢測不一致的樣本中，2例PCR法檢測結果為MSI-H，IHC法檢測結果為pMMR。Carethers等[17]也有類似報道。主要MMR蛋白包含MLH1、MSH2、PMS2、MSH6及PMS1，分析原因可能存在PMS1或其他未知蛋白表達缺失而導致MSI-H。因此，當PCR法檢測結果為MSI-H，IHC法檢測結果為pMMR時建議以PCR法檢測結果為準。5例PCR法檢測結果為MSS，IHC法檢測結果為dMMR,其中2例MSH6蛋白單獨缺失。有報道MSH6單獨缺失時由于其功能冗余，PCR檢測可能表現(xiàn)為MSS[18]；3例腫瘤含黏液腺癌，Muller等[19]提出黏液腺癌建議用顯微切割技術選擇癌細胞豐富區(qū)做PCR檢測，可能與送檢組織含黏液腺癌腫瘤實際占比<50%有關。

本研究結果顯示，CRC中dMMR/MSI-H患者具有發(fā)病年齡早、腫瘤直徑?！?cm、好發(fā)于右半結腸、組織學類型以黏液腺癌多見、臨床分期多發(fā)生于Ⅱ期、淋巴結未轉移多見，與大多數研究結果基本一致。Kawakami等[20]研究顯示，CRC中dMMR/MSI-H患者與分化程度有關，Raut等[21]研究發(fā)現(xiàn)MSI腫瘤多為女性。本實驗結果顯示，CRC中dMMR/MSI-H患者與性別和分化程度無關，分析原因可能與研究人群的種族分布以及樣本數量有關。

綜上所述，盡管兩種檢測方法具有較高的一致性，但均存在漏檢的可能，因此有條件的醫(yī)院可以用兩種方法同時進行檢測。MLH1與PMS2、MSH2與MSH6常協(xié)同表達或缺失。