線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白酶PRDX3在主動(dòng)脈夾層中的表達(dá)及其意義

鄭思豪 王志維

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)是一種極其兇險(xiǎn)的大血管疾病，起病急驟，病死率高[1]。典型的AD表現(xiàn)為主動(dòng)脈內(nèi)膜撕裂，血液由破口涌入中膜內(nèi)，主動(dòng)脈中膜沿長(zhǎng)軸分離，形成假腔。AD主要病理改變?yōu)橹鲃?dòng)脈中層退行性變(aortic media degeneration，AMD)，AMD的特征是主動(dòng)脈中層血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的損失、細(xì)胞外基質(zhì)紊亂、彈性纖維斷裂以及蛋白聚糖和葡糖胺聚糖的聚集。其組織學(xué)特征包括慢性外膜和中膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、彈性蛋白斷裂和變性以及由跨壁血管炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)構(gòu)成的中膜衰減[2]。

現(xiàn)有研究顯示，線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激等具有極其重要的作用,其在腫瘤、心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病、心肌梗死后的缺血再灌注損傷等中均發(fā)揮重要作用[3]。但是線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激與AD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其在主動(dòng)脈平滑肌(VSMCs)凋亡中的作用聯(lián)系尚未有具體的研究。本研究通過(guò)分析線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白-過(guò)氧化還原酶3(PRDX3)在AD患者和AD大鼠模型主動(dòng)脈組織中的表達(dá)差異情況，研究其在主動(dòng)脈夾層發(fā)生過(guò)程中的作用，旨在為主動(dòng)脈夾層診療提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

1.標(biāo)本與實(shí)驗(yàn)分組:選取2018年8月～2019年4月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院確診為StanfordⅠ型夾層并行胸主動(dòng)脈全弓置換患者14例為AD組(n=14)，患者均經(jīng)過(guò)CTA檢查確診為胸主動(dòng)脈夾層，三維重建的結(jié)果顯示破口位于升主動(dòng)脈。所有患者術(shù)前均無(wú)冠心病、外周血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、膜性腎病。患者均在入院后行急診手術(shù)，術(shù)中取AD患者病變組織。組織取出后用預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液漂洗，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。另選取5例心臟移植患者作為對(duì)照組(此5例患者均無(wú)大血管疾病，其在心臟移植術(shù)中取下的心臟主動(dòng)脈血管可作為相對(duì)正常主動(dòng)脈血管組織)。術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)方案均已告知家屬，并簽署知情同意書(shū)，且該部分實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批同意[倫理審批編號(hào)：WDRM動(dòng)(福)第20201107號(hào)]。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型構(gòu)建：選用SPF級(jí)野生型4周齡SD大鼠18只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2015-0027]，飼喂于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用數(shù)字表法隨機(jī)分為AD組(n=9)及對(duì)照組(n=9)。AD組飼喂含0.3%β-異氨基丙腈酯(BAPN)的維持飼料進(jìn)行主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型構(gòu)建，對(duì)照組飼喂普通飼料。動(dòng)物模型構(gòu)建后密切觀察造模大鼠生存狀況，若大鼠在造模過(guò)程中死亡，立即解剖明確死因，并收集主動(dòng)脈撕裂范圍的主動(dòng)脈組織標(biāo)本。4周后各組存活大鼠統(tǒng)一取材(AD組取主動(dòng)脈撕裂部位，對(duì)照組取相應(yīng)部位血管)，主動(dòng)脈標(biāo)本液氮凍存或4%多聚甲醛固定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.氧化應(yīng)激細(xì)胞模型構(gòu)建：培養(yǎng)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HASMC)至80%后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的H2O2，對(duì)照組不做處理。

4.實(shí)驗(yàn)試劑：PRDX3抗體購(gòu)自中國(guó)北京Bioss生物技術(shù)公司；β-氨基丙腈酯(BAPN)購(gòu)自日本TCI公司(貨號(hào)A0796)；β-actin抗體購(gòu)自中國(guó)武漢Servicebio生物技術(shù)公司；抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(貨號(hào)：5151P)。

5.Western blot法實(shí)驗(yàn)：按照分組要求處理組織后，取約100mg組織于1.5ml EP管內(nèi)，加入含有適量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，液氮研磨儀研磨組織。所得樣品于冷凍離心機(jī)中以4℃ 12000r/min離心20min，取上清，所收集上清液置于冰上超聲碎裂。根據(jù)所獲得蛋白上清液的體積，以適當(dāng)?shù)谋壤尤?×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃金屬浴15min，所獲蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上樣量為10μg，電泳電壓90V，電流40mA，以12%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進(jìn)行Western blot法電泳。在電流200mA，電壓100V條件下電轉(zhuǎn)2h。其后TBST洗膜，5%脫脂奶粉封閉1.5～2.0h，一抗(anti-PRDX3)4℃搖床孵育過(guò)夜，β-actin為內(nèi)參，以山羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統(tǒng)上掃膜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

6.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)：各組標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片。選取適量切片后將切片置于65℃恒溫烘箱中加熱融蠟2h，然后放入二甲苯溶液中脫去殘留的石蠟，進(jìn)行常規(guī)的水化步驟后用PBS漂洗。用triton試劑破膜15min，而后在枸櫞酸緩沖溶液中進(jìn)行微波加熱修復(fù)。自然冷卻后，用3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清常溫封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜。室溫復(fù)溫1h，二抗避光孵育1h。用DAB染色液在顯微鏡下顯色，顯色后蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，漂洗干凈后進(jìn)行風(fēng)干，中性樹(shù)脂封片，最后在全自動(dòng)顯微鏡下觀察拍照。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：以Graghpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)量資料的兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兩組人體主動(dòng)脈組織中PRDX3表達(dá)比較:Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AD組患者主動(dòng)脈血管PRDX3的表達(dá)在mRNA水平及蛋白水平均較對(duì)照組主動(dòng)脈明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖1)；人體組織免疫組化結(jié)果顯示，AD患者主動(dòng)脈組織中PRDX3表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，表現(xiàn)為顯微鏡下主動(dòng)脈血管中膜中出現(xiàn)大量高表達(dá)的陽(yáng)性型號(hào)(圖2)，用Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，AD組與對(duì)照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Western blot法檢測(cè)人體組織PRDX3表達(dá)

圖2 人體主動(dòng)脈組織標(biāo)本間免疫組織化學(xué)染色

2.兩組大鼠主動(dòng)脈組織中PRDX3的表達(dá):免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD組較對(duì)照組PRDX3表達(dá)明顯增高，表現(xiàn)為顯微鏡下主動(dòng)脈組織胞質(zhì)中出現(xiàn)大量高表達(dá)的陽(yáng)性型號(hào)(圖3)。

圖3 大鼠主動(dòng)脈組織免疫組織化學(xué)染色

3.不同組H2O2濃度下HVSMCs表達(dá)PRDX3的比較：HVSMCs培養(yǎng)至80%加入過(guò)氧化氫處理后，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2實(shí)驗(yàn)組PRDX3的表達(dá)隨著H2O2濃度的升高而增高(圖4)，并在蛋白水平較對(duì)照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞模型內(nèi)PRDX3表達(dá)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者主動(dòng)脈組織中過(guò)氧化物還原酶3的表達(dá)在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均較正常對(duì)照主動(dòng)脈組織明顯增加，提示在主動(dòng)脈夾層發(fā)病過(guò)程中線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激水平明顯升高。同時(shí)在免疫組化染色中發(fā)現(xiàn)，在胞質(zhì)中出現(xiàn)的大量陽(yáng)性信號(hào)也提示在線(xiàn)粒體中可能發(fā)生了氧化應(yīng)激水平的升高，表現(xiàn)為AD組中PRDX3的表達(dá)較正常對(duì)照組的明顯增高。但是由于人體組織標(biāo)本之間存在的年齡、性別、家族遺傳、生活條件差異性可能帶來(lái)不可避免的誤差，會(huì)導(dǎo)致樣本均一性相對(duì)較差。為此本研究構(gòu)建了大鼠主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型，進(jìn)一步證實(shí)線(xiàn)粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白PRDX3的表達(dá)升高可能與主動(dòng)脈夾層具有密切的聯(lián)系。

主動(dòng)脈夾層作為一類(lèi)致死率極高的主動(dòng)脈疾病，其病理變化表現(xiàn)包括主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的丟失和凋亡過(guò)多，彈力纖維斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積過(guò)多[4]。既往研究更多地涉及血管組織的中膜結(jié)構(gòu)，而對(duì)于線(xiàn)粒體這一細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器涉及較少。線(xiàn)粒體作為體內(nèi)主要的供能細(xì)胞器，其功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)的紊亂[5, 6]。同時(shí)線(xiàn)粒體是大量的氧化還原反應(yīng)的場(chǎng)所所在，主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)器官系統(tǒng)的功能失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)超氧離子的聚集導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)損傷從而功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生主動(dòng)脈夾層。線(xiàn)粒體對(duì)氧化還原應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)可能涉及線(xiàn)粒體通道，如線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)和內(nèi)膜陰離子通道(IMAC)。它們的激活導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)和線(xiàn)粒體間氧化還原環(huán)境的改變，從而導(dǎo)致ROS的釋放[7]。AD的發(fā)展進(jìn)程中長(zhǎng)期全身炎性介質(zhì)的釋放可能參與其中，帶來(lái)的是過(guò)量的ROS產(chǎn)生和聚集，而ROS的上升超過(guò)“正常”或“生理”的閾值水平，會(huì)導(dǎo)致一種通常被稱(chēng)為“氧化應(yīng)激”的過(guò)程[8,9]。在正常生理?xiàng)l件下，線(xiàn)粒體負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)大部分H2O2的產(chǎn)生，ROS也能作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子發(fā)揮作用，既往研究已經(jīng)證明，H2O2可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的表型改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致鈣化等血管病變[10，11]。

過(guò)氧化還原蛋白(peroxiredoxin，PRDX)是一個(gè)高度保守的過(guò)氧化物酶家族，其維持細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的動(dòng)態(tài)平衡[12]。該家族成員在大多數(shù)生物體中都有表達(dá)并參與各種生物學(xué)過(guò)程，在活性氧(ROS)產(chǎn)生、炎癥、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等中均發(fā)揮相應(yīng)作用[13～16]。哺乳動(dòng)物線(xiàn)粒體產(chǎn)生過(guò)量活性氧(ROS)所致的線(xiàn)粒體損傷是許多疾病中氧化損傷的基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激下線(xiàn)粒體產(chǎn)生的過(guò)量活性氧(ROS)可導(dǎo)致線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)、線(xiàn)粒體膜和DNA的氧化損傷，損害線(xiàn)粒體合成ATP及其廣泛代謝功能的能力，包括對(duì)大多數(shù)細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)至關(guān)重要的三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、尿素循環(huán)、氨基酸代謝、血紅蛋白合成和FeS中心組裝[17]。線(xiàn)粒體氧化損傷時(shí)還可以通過(guò)增加細(xì)胞色素C(cyt C)等膜間隙蛋白從而激活細(xì)胞凋亡[18]。PRDX3作為一種內(nèi)源性過(guò)氧化物清除劑，在正常生理情況下，PRDXs的產(chǎn)生與ROS處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[19]。當(dāng)發(fā)生主動(dòng)脈夾層等疾病導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)，線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS，隨之而來(lái)的是線(xiàn)粒體內(nèi)的過(guò)氧化物清除劑-過(guò)氧化還原蛋白PRDX3的升高，用以清除過(guò)量的ROS。主動(dòng)脈夾層發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的大量ROS時(shí)伴隨而來(lái)的是機(jī)體隨之而來(lái)的PRDXs的上調(diào)，當(dāng)上調(diào)的PRDXs不足以清除過(guò)量的ROS時(shí)，過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體破碎，平滑肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層的發(fā)生。

綜上所述，在主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，ROS的爆發(fā)可以導(dǎo)致線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的發(fā)生，使線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激相關(guān)過(guò)氧化還原蛋白PRDX3上調(diào)；如果過(guò)氧化清除劑-PRDX3的產(chǎn)生不足以清除過(guò)量的ROS，線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)無(wú)法恢復(fù)，過(guò)量的ROS則會(huì)使得線(xiàn)粒體功能受損、破裂，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展。對(duì)主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探究能夠揭示主動(dòng)脈夾層這一危險(xiǎn)疾病的發(fā)病機(jī)制，從而為未來(lái)主動(dòng)脈夾層的早期治療提供新的治療思路及靶點(diǎn)。