植物精油對儲藏期間小麥污染優(yōu)勢真菌的抑制效果研究

張守梅 張娜娜 王興亞 陳利容 郭玉秋 劉開昌 龔魁杰

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，濟南250100）

谷物易受多種真菌污染。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，全世界約有25%的糧食遭受不同程度的真菌及毒素污染[1]。真菌污染不僅可能會導(dǎo)致糧食品質(zhì)下降、損失率增加，部分真菌次級代謝產(chǎn)物還有致癌、致畸、造成死亡等危害。由鐮刀菌產(chǎn)生的嘔吐毒素主要作用于消化系統(tǒng)的胃和腸道，黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素是致癌、致畸最強的毒素，另外還有玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素等。這些真菌毒素污染的谷物制成飼料，會通過食物鏈導(dǎo)致肉、奶和蛋制品含有毒素，給人畜增加了巨大的安全隱患。

目前在糧食安全儲藏應(yīng)用中常用熱處理、電子束輻照、臭氧儲存等物理方法[2～4]和吡咯苯類、咪唑類、硫氰酸類等化學(xué)殺菌劑[5]來抑制或殺死有害微生物。物理方法雖然安全性高，但操作繁瑣、成本高、對參數(shù)調(diào)節(jié)要求嚴格。使用化學(xué)農(nóng)藥雖然可以抑制蟲蝕，降低霉變損失，但是環(huán)境污染重，容易造成糧食本身的營養(yǎng)流失以及食品安全問題。植物精油是從植物組織中提取出來的具有芳香氣味、常溫下能揮發(fā)的油狀液體，其成分復(fù)雜，主要是萜類化合物，有的含有脂肪族化合物或小分子芳香族化合物[6]。研究表明，植物精油對植物病原真菌[7～9]、細菌[10～12]和病毒[13]均有一定的抑制效果。此外，植物精油還可應(yīng)用于食品保鮮、驅(qū)蟲醫(yī)藥等領(lǐng)域[14～15]。

小麥是山東省主要的糧食作物?？刂苽}儲過程中真菌爆發(fā)，保證糧食不受真菌毒素污染是當(dāng)前糧食產(chǎn)后減損的重要手段之一。本文針對山東省禹城市農(nóng)戶儲糧小麥的表面污染真菌進行分離培養(yǎng)，選取6種植物精油對優(yōu)勢真菌抑菌活性進行研究，并篩選抑菌效果良好的精油，確定復(fù)配比例，并應(yīng)用到糧食倉儲中。

一、材料與方法

（一）材料與試劑本試驗所用小麥樣品取自山東省德州市禹城市農(nóng)戶家普通倉儲小麥，用無菌自封袋裝，當(dāng)天帶回實驗室進行污染真菌的分離。

試驗所用植物精油為肉桂精油、花椒精油、丁香精油、牛至精油、冬青精油、檸檬精油，均為單方精油，購自廣東晶晶生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），北京陸橋技術(shù)有限公司；乳酸、甘油、無水乙醇、75%消毒酒精、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、丙酮、磷酸銨、乙二胺四乙酸鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；通用引物ITS1/ITS 4、2×Taq DNA Master Mix均由青島擎科生物測序有限公司提供。

（二）儀器與設(shè)備SW－CJ－2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；XW－80A旋渦混合儀，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；恒溫金屬浴，米歐儀器；LDX－50KBS立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Axio Observer倒置熒光顯微鏡，德國蔡司；臺式離心機，Eppendorf公司；PCR儀，Heal Force生物公司。

（三）真菌的分離純化鑒定

1.真菌的分離和純化。在超凈工作臺中，取10 g小麥樣品于裝有90 mL無菌去離子水的錐形瓶中，密封后以200 r/min于室溫下振蕩30 min，并將上清液依次稀釋至0.1、0.01、0.001、0.000 1的濃度梯度，分別取100μL涂布在含青霉素和硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3～5 d后進行菌落的分離純化，純化后的真菌用無菌保種管4℃保存。

2.真菌的鑒定。觀察菌落顏色、大小，菌絲形態(tài)等特征，制作臨時裝片，在攝像顯微鏡下觀察菌絲表面形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子的著生情況、大小形態(tài)等特征，進行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

利用熱裂解法[16]提取菌落基因組，并進行基于18 s核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Trans cribed Spacer，ITS）的序列鑒定，通用引物為ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’和ITS4：5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’。

PCR擴增反應(yīng)體系（25μL）：2×Taq PCR MasterMix，12.5μL； 模板DNA，1μL； ITS1，1 μL； ITS4，1μL； ddH2O補足至25μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，94℃1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；4℃保存。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶明亮清晰的樣品送往青島擎科測序公司測序。

（四）精油抑菌試驗濾紙片法[17]進行抑菌圈測定。制備所分離純化的真菌菌懸液，使其濃度為1×106～5×106CFU/mL。取100μL菌液均勻涂布到PDA平板中，制成帶菌平板。吸取精油5μL加入到無菌濾紙片中，3個濾紙片均勻分布到平板表面，封口膜密封后室溫環(huán)境下培養(yǎng)7 d，測量抑菌圈直徑。設(shè)置空白對照，每個處理重復(fù)3次。

抑菌圈試驗判定標準參考：抑菌圈直徑>20 mm，高度敏感；直徑為10～20 mm，中度敏感；直徑為5～10 mm，低度敏感。

（五）最小抑菌濃度（MIC）測定在無菌培養(yǎng)皿中倒入20 mLPDA培養(yǎng)基，冷卻凝固后，將100μL菌懸液涂布到含有PDA的平板上，制成含菌平板。精油稀釋后，滴加到濾紙片中，每片濾紙片加入10μL精油稀釋液，將濾紙片貼于平皿中央，封口膜封口。精油在平皿中培養(yǎng)基上方的空氣濃度為0～15μL/mL。以無菌絲生長的最低精油濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

（六）聯(lián)合抑菌實驗選擇抑菌效果好的單方精油，以不同的比例配合，復(fù)配后的精油以丙酮作為稀釋液，吸取一定量的稀釋液滴加到濾紙片中，將濾紙片置于含菌平板中，封口膜封口后，室溫下培養(yǎng)7 d。以無菌絲長出的最低濃度為復(fù)合精油的MIC。聯(lián)合抑菌效果評價：以分級抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）作為聯(lián)合抗菌試驗效果的判定依據(jù)[18]。

FIC指數(shù)判定標準：FIC指數(shù)≤0.5時，為協(xié)同作用；0.52時，為拮抗作用。

（七）數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均測定3次，取3次平均值作為測定結(jié)果。用Microsoft Excel進行統(tǒng)計，用IBMSPSS Statistics 21軟件進行單因素方差分析（P<0.05）。

二、結(jié)果與分析

（一）真菌的分離鑒定

1.真菌的形態(tài)學(xué)鑒定。從倉儲小麥中分離的真菌數(shù)量最多的為曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬，另外還有少量的酵母菌、根霉、黑孢霉、枝孢屬真菌。其中優(yōu)勢真菌如圖1所示，根據(jù) 《真菌鑒定手冊》[19]結(jié)合所分離真菌的菌落和顯微形態(tài)，可以初步鑒定圖1a為黃曲霉菌；圖1b為尖孢鐮刀菌；圖1c為草酸青霉；圖1d為鏈格孢菌。

圖1 小麥污染真菌菌落及顯微形態(tài)（40×10）

2.真菌的分子鑒定。對優(yōu)勢真菌ITS序列測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中在線比對，選擇相似度高的菌株序列，利用MEGA7.0，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。

圖2 優(yōu)勢污染真菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

（二）單一植物精油對污染優(yōu)勢真菌的抑制效果6種植物精油對4種真菌的部分抑菌效果如圖3所示，測量抑菌圈直徑（包含濾紙片直徑），其結(jié)果見表1。

圖3 部分精油抑菌活性圖

表1 單一植物精油的抑菌效果

其中以肉桂精油和牛至精油對污染優(yōu)勢真菌的抑菌效果最好，4種污染真菌對二者均高度敏感；其次是丁香精油和冬青精油，但冬青精油對黃曲霉不具有抑菌作用，其他3種真菌對冬青精油高度敏感，4種真菌對丁香精油均高度敏感，但除鏈格孢外，對其他3種真菌的抑菌直徑均顯著小于肉桂精油和牛至精油（P<0.05）；污染真菌對花椒精油中度敏感，對檸檬精油低度敏感，且花椒精油對黃曲霉、檸檬精油對黃曲霉和鏈格孢菌均無抑菌效果。結(jié)果表明，肉桂精油和牛至精油對4種污染真菌的抑菌效果最好，可以認為肉桂和牛至兩種植物精油對小麥儲藏期間的污染真菌具有廣譜抑菌效果。

（三）單一植物精油的最低抑菌濃度MIC是指能夠完全抑制病原菌生長的最小濃度，MIC越小，說明精油對病原真菌的抑菌活性越強[20]。為了解各植物精油對小麥儲藏期間優(yōu)勢污染真菌的抗菌效果，通過測定各植物精油的最低抑菌濃度（MIC）對其抗菌效果進行分析，結(jié)果見表2。肉桂精油對尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，MIC值為0.9±0.1μL/mL，對黃曲霉菌、鏈格孢菌和草酸青霉的MIC值分別為3.5±0.1、4.6±0.1、6.9±0.1 μL/mL；牛至精油對黃曲霉的抑菌效果最好，MIC為2.7±0.1μL/mL，其次是草酸青霉、尖孢鐮刀菌和鏈格孢菌， 分別為3.0±0.1、3.1±0.6、3.5±0.1 μL/mL；丁香精油對草酸青霉和鏈格孢菌的抑菌效果最好，MIC分別為3.3±0.2、3.4±0.2μL/mL， 其次是黃曲霉和尖孢鐮刀菌分別為6.7±0.1、6.8±0.4 μL/mL；冬青精油對尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，MIC為3.5±0.1μL/mL，其次是鏈格孢和草酸青霉，MIC分別為6.3±0.4、6.8±0.2μL/mL， 但對黃曲霉無抑菌效果；檸檬精油和花椒精油無法完全抑制4種真菌的生長，抑菌效果較差。

（四）復(fù)合精油的聯(lián)合抑菌效果評價對抑菌效果較好的精油按照不同比例進行復(fù)配，可以提高植物精油的廣譜抑菌活性[21]。根據(jù)單方精油的抑菌直徑和最低抑菌濃度，選用肉桂精油和牛至精油分別按照肉桂與牛至1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1的比例進行復(fù)配，其聯(lián)合抑菌效果如表3所示。由表3中結(jié)果可見，肉桂精油和牛至精油的FIC指數(shù)均≤0.5，說明兩者在不同的復(fù)配比例下對真菌的抑菌為協(xié)同作用。肉桂精油∶牛至精油為1∶2時，F(xiàn)IC指數(shù)最低，此時兩者協(xié)同抑菌效果最佳，對尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，最小抑菌濃度為0.08μL/mL；其次是黃曲霉，MIC為0.12 μL/mL；草酸青霉，MIC為0.21μL/mL；鏈格孢菌，MIC為0.31μL/mL。肉桂精油∶牛至精油為1∶2時，對4種真菌的空氣抑菌濃度為0.31 μL/mL時抑菌效果最好。

表2 單一植物精油的最低抑菌濃度指數(shù)

表3 肉桂精油和牛至精油復(fù)合精油的最低抑菌濃度和分級抑菌濃度指數(shù)

三、討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)基于ITS序列鑒定，從農(nóng)戶儲藏小麥中分離出污染優(yōu)勢真菌分別為黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和青霉菌4種污染真菌，這與前人從儲藏小麥中分離出的污染優(yōu)勢真菌的結(jié)果相一致[22～23]。研究表明，黃曲霉的次級代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素具有強烈的致癌作用，鐮刀菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物嘔吐毒素（DON）作用于人畜消化道，引起中毒現(xiàn)象，鏈格孢菌是小麥黑胚病的主要病原菌，而青霉屬真菌是糧食儲藏不當(dāng)，導(dǎo)致霉菌爆發(fā)的主要原因。因此這4種真菌是引起糧食安全的重要原因。

植物精油本身是一種高效安全的植物源抑菌或殺菌劑，目前已經(jīng)被廣泛用作植物病害防治中。董路路等[24]研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油、肉桂精油和丁香精油對青霉菌具有較強的抑制效果；趙娜娜等[9]發(fā)現(xiàn)，肉桂精油對萎蔫專化型尖孢鐮刀菌具有較好的抑菌活性；徐丹等[25]發(fā)現(xiàn)，肉桂精油能夠?qū)S曲霉菌絲體和孢子造成嚴重損傷，對黃曲霉生長和產(chǎn)毒的抑制率高達100%；有研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油、牛至精油和丁香精油對容易引起果蔬真菌病害的鏈格孢菌具有較強的抑菌效果[26～27]。本研究對單一精油的抑菌結(jié)果顯示，肉桂精油、牛至精油對黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和青霉菌的抑菌效果最佳，以肉桂精油對尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，MIC為0.9μL/mL，花椒精油、檸檬精油和冬青精油對黃曲霉菌不具有抑菌效果，檸檬精油對鏈格孢菌無抑菌作用。

有大量的研究證明，對不同植物精油進行復(fù)配的抑菌效果更優(yōu)于單一精油的抑菌效果。曲春陽[28]利用肉桂精油與大蒜精油3∶1的比例進行復(fù)配對大米中黃曲霉菌的抑菌效果最好。JORGE等[29]將牛至精油和馬郁蘭精油、百里香精油復(fù)配均對病原菌具有相加的抑菌效果。本試驗對肉桂精油和牛至精油進行不同比例復(fù)配，發(fā)現(xiàn)肉桂精油和牛至精油在不同配比下均呈現(xiàn)協(xié)同抑菌的效果，且以1∶2的配比下兩種精油的協(xié)同抑菌效果最佳。其機理可能是協(xié)同作用的精油對病原菌細胞壁活性成分和保護性酶的連續(xù)抑制作用，增強了細胞對精油活性成分的吸收，進一步達到破壞細胞膜，抑制甚至殺死病原菌的效果[30]。

植物精油對糧食儲藏過程中有害微生物的抑制作用目前以理論研究居多，接下來本研究將根據(jù)本次研究結(jié)果及前人的經(jīng)驗，初步開展小糧倉儲糧過程中植物精油防霉包的研發(fā)和應(yīng)用。王利敏[31]利用肉桂精油、檸檬精油、丁香精油和薄荷精油按照一定比例制成防霉劑對儲藏在倉庫中的玉米進行為期12個月的熏蒸處理，發(fā)現(xiàn)精油防霉劑處理對菌落總數(shù)的抑制率高達89%，對黃曲霉和鐮刀菌的抑制率達到99.4%和100%，并能夠有效抑制真菌毒素的合成。劉曉麗等[32]在恒溫恒濕條件下對大米進行模擬儲藏，探究肉桂精油對糧食儲藏中常見的霉菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)肉桂精油濃度在150 mg/L以上時，大米沒有發(fā)生霉變現(xiàn)象；在175 mg/L以上時能夠完全抑制霉菌孢子的生長。也有學(xué)者利用植物精油對糧倉進行熏倉，能夠抑制或殺死儲糧常見害蟲，起到驅(qū)蟲、避蟲和殺蟲的效果[33]。植物精油作為一種安全性高、操作簡單的防霉抑菌劑，應(yīng)用在糧倉儲存中具有重大的研究和開發(fā)價值。

四、結(jié)論

本研究結(jié)果表明，肉桂精油、牛至精油、冬青精油、丁香精油、花椒精油和檸檬精油對從儲藏小麥中分離出的優(yōu)勢病原真菌黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和草酸青霉的抑菌效果不同，以肉桂精油和牛至精油的抑菌效果最好，抑菌圈直徑均在42 mm以上；采用肉桂精油和牛至精油以不同的比例進行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同抑菌效果，且以1∶2比例復(fù)配時對4種優(yōu)勢污染真菌的協(xié)同抑菌效果最好。因此肉桂精油和牛至精油按照一定比例復(fù)配，可作為一種具有良好應(yīng)用前景的糧食防霉保鮮劑。