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    多肽組學(xué)技術(shù)在乳品研究中的應(yīng)用

    2021-12-25 06:28:22王少雷譚冬飛蘇美丞張清陽
    關(guān)鍵詞:酪蛋白多肽組學(xué)

    王少雷 譚冬飛 張 霞 蘇美丞 張清陽 賈 曼 陳 剛

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室,北京100081)

    乳和乳制品對人體營養(yǎng)至關(guān)重要,是氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、水溶性維生素、鈣、必需脂肪酸和其他幾種生物活性化合物的載體,在多種生物化學(xué)和生理功能中具有重要意義。牛奶肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個分支領(lǐng)域,主要研究存在于牛奶基質(zhì)中的肽的組成、相互作用和性質(zhì)。牛奶中的肽具有抗菌、抗氧化、抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)等活性的保健功能性食品的潛在成分[1]。牛奶中抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用[2],這類肽N末端常為親水性氨基酸殘基,如賴氨酸、精氨酸等;C末端含被酰胺化疏水殘基如丙氨酸、甘氨酸等[3]。FARVIN等[4]發(fā)現(xiàn)抗氧化肽幾乎都含有1個脯氨酸殘基,部分為含有脯氨酸、組氨酸或酪氨酸,且N末端含有疏水氨基酸的肽段。LEE等[5]研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)ACE抑制肽在C末端含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基和脯氨酸氨基酸殘基,且亮氨酸對增加ACE抑制肽抗血壓能力有顯著加強作用。

    牛奶中生物活性肽主要是通過耐熱性蛋白酶從乳蛋白中釋放出來。牛乳中的耐熱蛋白酶來源于乳本身(即內(nèi)源性蛋白酶)和牛乳污染微生物(外源性蛋白酶)[6]。內(nèi)源性蛋白酶主要是纖溶酶,一般是由血液轉(zhuǎn)運至乳腺并分泌進入乳中;外源性蛋白酶主要是嗜冷菌胞外蛋白酶,原料乳中的嗜冷菌大多數(shù)來自榨乳過程各環(huán)節(jié)造成的污染[7]。這些酶耐熱性較強,即使是UHT乳中纖溶酶的活性尚存30%~40%,殘留的酶活性將在產(chǎn)品貨架期內(nèi)緩慢作用于牛奶蛋白而導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)黏度增加、蛋白凝結(jié)和乳清析出等質(zhì)量問題[8]。本文對多肽組學(xué)技術(shù)研究手段以及其在乳品中的應(yīng)用進行了綜述,以期為乳品多肽組學(xué)的相關(guān)研究提供參考。

    一、多肽組學(xué)技術(shù)

    肽組學(xué)一詞最早于2000年2月由SCHULZKNAPPE在美國生物分子資源設(shè)施協(xié)會年會(ABRF)“從單一到全球生物系統(tǒng)分析”上提出[9]。該方法已在神經(jīng)內(nèi)分泌研究、生物標志物或藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域取得成功。多肽組學(xué)是對生物樣品中的肽進行全面定性和定量描述的技術(shù),主要研究分子量為0.5~15 kDa的肽或小分子蛋白質(zhì),這正是傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)難以覆蓋的區(qū)域[10]。

    肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新方向,許多蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析工具可以直接用于肽組學(xué),因為后者在某種程度上是前者的一個子領(lǐng)域。但兩者也有所區(qū)別,牛奶樣品中多肽含量極低,而且容易被大量高豐度蛋白質(zhì)掩蓋其多肽組信息;很多小分子量蛋白質(zhì)多肽和高豐度蛋白結(jié)合在一起,去除高豐度蛋白質(zhì)的同時不可避免地會造成這些小分子蛋白質(zhì)多肽的丟失,即導(dǎo)致多肽組信息的丟失。因此多肽組學(xué)研究也需要特定工具擴展、發(fā)明和驗證程序的出現(xiàn)。多肽組學(xué)這一新概念旨在對小多肽進行全面的可視化和分析,從而涵蓋蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)之間的質(zhì)量范圍[11]。

    (一)肽的提取與分離生物基質(zhì)通常含有脂類、鹽、蛋白質(zhì)和碳水化合物,這些物質(zhì)會降低肽的電離效率,并可能導(dǎo)致液相色譜平臺污染的問題。因此利用質(zhì)譜技術(shù)從復(fù)雜的生物基質(zhì)中鑒定和定量分子,通常需要對感興趣的化合物進行選擇性富集[12]。多肽提取方法具有高度多樣性,并在一定程度上受到蛋白質(zhì)組學(xué)方法的指導(dǎo),且每種方法均具有自己獨特的優(yōu)勢并且互為補充。

    1.有機溶劑沉淀法。有機溶劑沉淀法是最簡單的除去復(fù)雜樣品中大分子蛋白質(zhì)的方法。其原理是加入有機溶劑降低了溶液的介電常數(shù),導(dǎo)致溶液中大分子量蛋白質(zhì)之間疏水作用力下降、靜電作用力增強,從而使其蛋白質(zhì)發(fā)生聚集析出,而溶液中的多肽溶解在有機溶劑中達到分離目的[13]。經(jīng)常使用的一種簡單方法如通過加酸(如三氯乙酸)、使用不同的有機溶劑(如冷丙酮)或這些沉淀劑的組合以達到沉淀蛋白質(zhì)的目的。劉媛等[14]通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化硫酸銅、飽和食鹽水、乙醇、乙酸鉛、三氯乙酸沉淀牛乳中蛋白氮的最佳沉淀條件,結(jié)果表明,三氯乙酸為沉淀牛乳中蛋白質(zhì)的最佳沉淀劑。馬玉敏等[15]對比了不同種類和比例的有機溶劑提取乳制品中多肽,通過檢測MALDI響應(yīng)值高低和出峰范圍,確定牛奶和乙腈比例為1∶3時提取效果最佳。DALABASMAZ等[16]采用5%醋酸調(diào)節(jié)牛奶pH值至4.6達到酪蛋白等電點的方式將其離心除去,收集上清液用于多肽檢測。

    樣品采集后的另一個重要初步步驟是防止進一步的蛋白水解作用。蛋白酶活性可通過蛋白質(zhì)變性、使用溶劑和三氯乙酸選擇性沉淀、微波輻射或添加蛋白酶抑制劑來降低。選擇不改變肽結(jié)構(gòu)的抑制劑和使用不掩蓋質(zhì)譜中肽信號的濃度很重要[17~18]。該方法相對于其他方法具有快速、簡單、成本低的優(yōu)勢。NEBBIA等[19]采用體外動態(tài)系統(tǒng)對生母乳、高溫短時殺菌母乳和低溫長時殺菌母乳樣品添加兔胃提取物進行胃腸消化模擬,消化30、60和90 min后加入胃蛋白酶抑制劑A防止進一步消化。

    2.超濾離心法。超濾技術(shù)是以膜表面的微孔結(jié)構(gòu)為介質(zhì),以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力對樣品進行選擇性分離的膜分離技術(shù)[13]。根據(jù)實驗需求選擇特定分子截留量的超濾膜,樣品經(jīng)過超濾后只允許溶液中小于特定分子量的多肽通過,而大于特定分子量的蛋白質(zhì)被截留在膜上方從而達到選擇性分離。超濾技術(shù)在多肽組學(xué)樣品前處理中得到了廣泛應(yīng)用,但該方法的最主要問題是超濾時上層濃縮后的大分子堵塞膜孔,出現(xiàn)差率速度降低或堵塞,而且其他低分子量污染物例如鹽類也會同時被濃縮,不利于進一步分離和檢測。因牛奶中主要蛋白質(zhì)為酪蛋白、乳白蛋白和乳球蛋白,分子量較大,故采用超濾方法除去蛋白時最常用的是10 kD超濾膜。

    3.固相萃取法。固相萃?。⊿PE)是用于分析前處理和純化樣品的一種常規(guī)方法。該方法通常用于脫鹽和去除高含量蛋白質(zhì),作為液相色譜多級分離純化和濃縮肽與蛋白質(zhì)的替代方法。SPE可以根據(jù)聚合物吸附劑的色譜相互作用在樣品中分離。較短的烴鏈(如反相C4和C8)通常用于蛋白質(zhì)的分離。盡管較長的烴鏈(C18)是分離小分子和肽的首選[20],但其主要缺點是在多肽組分被富集的同時,樣品中高含量的蛋白質(zhì)也會被富集出來,降低了多肽樣品的富集效率和選擇性。常用StageTip對牛奶中肽混合物進行脫鹽和除去高豐度蛋白并濃縮,具有選擇性地富集或預(yù)分餾。StageTip作為自制工具具有靈活和低價格的特性,與ZipTips(Millipore)商業(yè)產(chǎn)品對比,除了成本相對較低外,ZipTips還存在回收率低和洗脫量大等問題,故StageTip得以廣泛應(yīng)用[21]。

    (二)肽分析牛乳中存在573種蛋白質(zhì)[22],其中大多數(shù)肽來源于αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白。根據(jù)多肽的氨基酸數(shù)目,可將肽組學(xué)分為3組,即大肽(>25個氨基酸)、中肽(7~25個氨基酸)和小肽(<7個氨基酸)[23],其中大多數(shù)生物活性肽屬于小肽。由于缺乏短而獨特的蛋白質(zhì)序列,因此單靠數(shù)據(jù)庫搜索無法提供有用的肽序列信息,這對基于質(zhì)譜的肽組學(xué)分析提出了挑戰(zhàn)。另外,當使用低碰撞能量時,串聯(lián)質(zhì)譜的質(zhì)量差[24],故采用更高的碰撞能量的飛行時間質(zhì)譜(TOF)和軌道離子阱(orbitrap)提供更高質(zhì)量的光譜和重現(xiàn)性[23,25]。

    大多數(shù)肽組學(xué)研究是采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)方法進行的。乳制品中生物活性肽屬于低質(zhì)量范圍,MALDI的基質(zhì)干擾影響很明顯,這嚴重限制了MALDI-MS在肽組學(xué)研究中的應(yīng)用。除液相色譜外,毛細管電泳(CE)也被廣泛應(yīng)用于多肽的分離。

    (三)肽的定量在定性分析之后,量化是下一個重要分析步驟。定量分析樣品間肽含量的微小差異是肽組學(xué)中最重要和最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。標記(同位素和等壓)和無標記定量均可用于肽組學(xué)。

    1.無標記定量。無標記肽定量可以通過提取肽信號強度或光譜計數(shù)來進行。離子信號強度法使用提取的色譜面積來比較不同樣品的肽豐度。光譜計數(shù)是指在數(shù)據(jù)依賴性采集實驗中,選擇1個肽進行碎片化和識別。盡管無標記定量通常被認為定量效果較差,但它不需要額外的樣品制備,允許使用更小的樣品量,并且所有分析平臺都可實施。目前牛奶中肽譜鑒定大多采用無標記定量方法完成,通過選擇內(nèi)標肽對比色譜峰面積進行相對定量。DALABASMAZ等[26]將200μL酸化乳樣品與50μL參考標準溶液(Biotin-XGXLDLRQGMFA-NH2)混合進行肽譜分析后,將參考肽m/z1558.8的強度設(shè)為100%,并與不同樣品的肽強度比較。最后選擇肽m/z1 589.9作為內(nèi)源性內(nèi)標物,在所有進一步的實驗中將其強度設(shè)為100%,然后進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)評估。

    2.等壓標記。等壓標記允許在單個分析中復(fù)用多個樣本,這提高了吞吐量,并且由于目標肽的共電離作用,使定量更加精確。主要的等壓標記方法是iTRAQ[27]和TMT[28],這些技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用,但僅在少數(shù)肽組學(xué)研究中得到應(yīng)用。

    3.同位素標記。質(zhì)譜定量通常是用同位素標記的樣品進行的。同位素標記與等壓標記相比,優(yōu)點是不需要肽碎片來進行定量。由于自動化MS/MS的循環(huán)時間通常不允許樣品中的所有肽碎片化,同位素標記至少在最初允許對更多肽進行定量。另一方面,隨著同位素的使用,離子信號的數(shù)量增加,同位素標記光譜更加復(fù)雜[12]。

    4.單反應(yīng)和多反應(yīng)監(jiān)測。一旦肽序列被識別出來,MRM就可以根據(jù)肽離子分解過程中形成的特定產(chǎn)物的檢測進行定量。MRM通常與三重四極桿儀器配合使用,廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量分析,具有高度的敏感性和特異性[12]。基于MRM的定量方法的一個主要缺點是,必須先對肽序列進行識別,才能確定要測量的目標。

    (四)生物信息學(xué)生物信息學(xué)是任何組學(xué)質(zhì)譜分析不可分割的一部分。多肽質(zhì)譜生物信息學(xué)一般通過兩方面進行,一是采用免費軟件對多肽的單同位素質(zhì)量計算、質(zhì)譜/質(zhì)譜碎片模式、理論同位素分布模式等進行分析;二是購買商業(yè)軟件如Mascot、PEAKS Studio、ProteinPilot等,對所得到的質(zhì)譜信息進行數(shù)據(jù)分析,例如De novo的肽序列測定和生物標記物發(fā)現(xiàn),得出質(zhì)譜對應(yīng)的肽段序列。肽數(shù)據(jù)庫是肽組學(xué)研究者最重要的工具,多肽組學(xué)常用數(shù)據(jù)庫主要有以下幾類[29],蛋白質(zhì)/肽序列數(shù)據(jù)庫:RCSB Protein Data Bank,https://www.rcsb.org/;UniProtKB,https://www.uniprot.org/;NCBI Protein,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/;BIOPEP,http://www.uwm.edu.pl/biochemia/; PepBank,http://pepbank.mgh.harvard.edu/;BioPD,http://biopd.bjmu.edu.cn/;SwePep,http://www.swepep.org/;EROPMoscow,http://erop.inbi.ras.ru/;MilkAMP,http://milkampdb.org/;PeptideDB,http://www.peptides.be/。蛋白質(zhì)水解酶數(shù)據(jù)庫和理論消化平臺:PeptideCutter, http://web.expasy.org/peptide_cutter/; Enzyme Predictor,http://bioware.ucd.ie/~enzpred/Enzpred.php。潛在生物活性預(yù)測:PeptideRanker,http://bioware.ucd.ie/~compass/biowareweb/;BIOPEP,http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep;AntiBP2,http://www.imtech.res.in/raghava/antibp2/。

    (五)肽組學(xué)深入分析牛奶肽組學(xué)的主要目的是尋找和表征生物活性肽,但也會涉及到蛋白質(zhì)組學(xué)研究。首先需要確定生物活性肽源于的蛋白質(zhì),對乳制品進行分析以確定在特定加工/貯存條件下蛋白水解途徑是肽組學(xué)研究的重要組成部分,它結(jié)合了肽組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)[30]。其次,需要對牛奶蛋白質(zhì)翻譯后修飾進行表征,已確定對活性的影響。

    二、多肽組學(xué)在牛奶上的應(yīng)用

    (一)基于肽譜鑒定不同溫度處理的牛奶近年來,人們認為肽組分的組成可能是反映牛奶熱處理的敏感和選擇性標記。牛奶和奶制品的肽譜受加熱過程的影響,不同的加熱程序通過選擇性熱蛋白裂解和選擇性滅活蛋白酶或蛋白酶抑制劑來改變肽譜[31~32]。此外,熱處理導(dǎo)致美拉德反應(yīng),其產(chǎn)生的自由基可以選擇性攻擊蛋白質(zhì)主鏈產(chǎn)生肽段[31]。HINDLE等[33]研究了牛乳經(jīng)熱處理后,溶于12%三氯乙酸(TCA)濾液中的肽和糖肽的釋放情況,得出隨著熱處理溫度的升高和熱處理時間的延長,肽釋放量增加。MORALES等[34]根據(jù)溶于12%三氯乙酸(TCA)濾液中的肽和糖肽的釋放情況檢測到兩個肽,在加熱過程中顯示出時間依賴性的增加。隨后,MELTRETTER等[35]將固定化金屬親和色譜(IMAC)與基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)結(jié)合分析對生乳天然肽部分進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)5種肽受到加熱時間和溫度依賴性的高度影響。SASSI等[36]使用MALDITOF-MS肽分析和主成分分析結(jié)合方法篩選出28種肽區(qū)分生牛乳、巴氏殺菌奶、UHT和奶粉。BAUM等[37]直接應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)或通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)或OFFGEL分餾對乳肽進行預(yù)分餾,用于綜合分析原料乳的肽譜鑒定出248種肽。EBNER等[31]結(jié)合使用C18-StageTip和MALDI-TOF-MS進行肽提取,對同一乳制品廠的高溫短時(HTST)、延長貨架期(ESL)和超高溫(UHT)牛奶的肽指紋鑒定,確定了16個肽的相對數(shù)量隨著熱負荷的增加而變化,并通過對購買的HTST牛奶加熱實驗得出β-酪蛋白196-209的肽(m/z1460.9)可能是一個非常敏感的熱影響肽標記物,被認為是商業(yè)牛奶樣品中的候選標記物之一。DALABASMAZ等[26]在StageTip微萃取后通過MALDI-TOF-MS鑒定巴氏殺菌奶、ESL奶和UHT奶選擇m/z為1701.0的焦谷氨酸-β酪蛋白194-209(pyroQ-βcasein194-209) 作為標志肽,通過UHPLC-ESI-MS/MS鑒定標記肽,用pyroQ-βcasein194-209可以將UHT牛奶與溫和加熱的牛奶區(qū)分開,準確度為100%。由于其高可靠性和靈敏度,該肽可用于常規(guī)分析以監(jiān)測乳的熱處理。DALABASMAZ等[16]通過MALDI-TOF-MS確定出7種標記肽的組合模型具有95%的準確度,以區(qū)分加熱ESL乳、過濾ESL乳以及巴氏殺菌乳。

    (二)基于肽譜鑒定牛奶貯藏時間MELTRETTER等[35]將IMAC與MALDI-TOF-MS結(jié)合分析,在4℃下對延長保質(zhì)期牛奶(ESL)進行的貯存試驗并未顯示肽譜的任何變化,而在室溫下貯存的UHT牛奶中,有一種肽(α-s1-酪蛋白的N-端)顯著增加。EBNER等[31]結(jié)合使用StageTip和MALDI-TOF-MS對同一乳制品廠的不同貯藏時間的高溫短時(HTST)和超高溫(UHT)牛奶的肽指紋鑒定,篩選出5種肽可鑒定不同貯藏時間的巴氏殺菌奶和14種肽可鑒定不同貯藏時間的UHT奶。DALABASMAZ等[38]通過MALDI-TOF-MS的非靶向肽分析對9種不同的商用超高溫樣品進行分析,記錄其保質(zhì)期內(nèi)和保質(zhì)期結(jié)束時的肽分布,對這些肽的相對定量和測序表明,β-酪蛋白192-206(m/z1668.9)是區(qū)分過期超高溫與常規(guī)超高溫樣品的最合適標記,準確率100%。此外,β-酪蛋白191-206(m/z1782.0)顯示100%特異性,β-酪蛋白139-161(m/z2696.4)顯示100%敏感性。因此,β-酪蛋白192-206單獨或與β-酪蛋白191-206和β-酪蛋白139-161結(jié)合,提供了一種基于蛋白質(zhì)水解機制監(jiān)測UHT牛奶貯存的可靠標記物。

    (三)基于肽譜鑒定牛乳腺炎患有乳腺炎的奶牛乳汁中纖溶酶、組織蛋白酶、彈性蛋白酶以及纖溶酶原激活劑會上調(diào)[39]。使用牛奶的多肽組學(xué)在臨床和亞臨床水平上檢測乳腺炎,觀察到健康牛奶中肽的總數(shù)是亞臨床乳汁的1.5倍[40]。乳腺炎是一種乳腺炎癥,是牛的一種常見疾病,導(dǎo)致產(chǎn)奶量低、質(zhì)量差。MANSOR等[41]采用毛細管電泳和質(zhì)譜技術(shù),對臨床乳腺炎奶牛和健康奶牛乳汁中的肽進行了研究,發(fā)現(xiàn)了154種可用作診斷性生物標志物的肽段;此外,還利用其中47個多肽來區(qū)分乳腺炎的病因是由金黃色鏈球菌還是大腸桿菌引起的。

    (四)基于肽譜鑒定奶摻假在乳品領(lǐng)域,最常見的欺詐行為之一是將價值較高的奶(綿羊和山羊奶)與牛奶摻假。GUARINO等[42]基于液相色譜/電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC/ESI-MS/MS)分析奶酪中酪蛋白提取物的肽,建立了一種能夠定量測定山羊和牛乳酪生產(chǎn)過程中添加綿羊奶的方法,該方法能夠檢測綿羊奶添加量為2%的奶酪。CALVANO等[43]基于直接基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜分析,鑒定了7個主要的牛乳肽標記物和2個山羊乳的肽標記物,可以檢測到牛奶和山羊奶最低摻假水平為5%。SASSI等[36]基于牛奶樣品的肽組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,通過直接分析脫脂樣品后,對鮮牛乳、水牛奶、綿羊奶和山羊奶的特異性肽和蛋白質(zhì)標記物進行了鑒定。

    三、展望

    多肽組學(xué)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新方向,主要研究分子量為0.5~15 kDa的肽或小分子蛋白質(zhì),涵蓋蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)之間的質(zhì)量范圍,是對乳品中的肽進行全面定性和定量描述,系統(tǒng)全面地研究乳品中多肽的組成、功能和變化。因牛奶樣品中多肽含量極低,易被大量高豐度蛋白質(zhì)掩蓋其多肽組信息,且很多小分子量蛋白質(zhì)多肽和高豐度蛋白結(jié)合在一起,導(dǎo)致傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理方法并不能完全適用。通過多肽組學(xué)研究可以幫助理解乳品中肽譜,尋找差異肽段研究其生物活性,從而為監(jiān)測加工工藝、儲藏時間、奶牛健康狀況和摻假提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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