唑吡坦抗原的合成與鑒定

袁強(qiáng)，梁飛敏，伍麗賢

（1.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，研發(fā)中心，廣東 廣州 510663；2.廣州正孚檢測有限公司 廣東正孚法醫(yī)毒物司法鑒定所，廣東 廣州 510663）

唑吡坦是一種咪唑吡啶類藥物，最初作為成癮藥物苯二氮?的安全替代品上市。唑吡坦作為“Z類藥物（Z-drugs）”的代表藥物之一[1]，能夠使機(jī)體產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用，是市面上常用的安眠類處方藥物[2]。受現(xiàn)今生活節(jié)奏的加快及壓力的影響，助眠類的保健食品市場不斷擴(kuò)大，因唑吡坦的鎮(zhèn)靜安眠效果突出，一些不法分子為達(dá)到其產(chǎn)品宣傳效果，通過往保健食品中違法添加唑吡坦，從中獲利。近年來，唑吡坦濫用致使人體中毒、精神不良，甚至死亡的案件報道逐年增加[3]。隨著對唑吡坦臨床的深入研究，數(shù)據(jù)表明長期使用高劑量會增加人體對唑吡坦的依賴性，造成機(jī)體對唑吡坦上癮的風(fēng)險[4]，有案例報道表明某患者過度服用唑吡坦后產(chǎn)生了對唑吡坦的耐受性和依賴性，并出現(xiàn)了意識模糊和幻覺等后遺癥[5]。因此，唑吡坦的濫用嚴(yán)重?fù)p害人體健康，有必要建立相關(guān)檢測方法加強(qiáng)對唑吡坦的監(jiān)控。

目前關(guān)于唑吡坦的檢測與監(jiān)控，主要通過氣相[6]或液相色譜法[7]、氣相或液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用等方法[8]。這些儀器方法選擇性好、靈敏度高，但儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，存在檢測耗時較長，檢測成本較高等問題，不適用于大量樣品的現(xiàn)場即時檢測。免疫檢測法是通過抗原抗體反應(yīng)來檢測樣品中濫用藥物分子的方法[9]，該方法操作簡單，耗時少，同時具備較好的檢測靈敏度和特異性，是目前國際上通用的一種濫用藥物現(xiàn)場檢測的方法[10]。因此，研究唑吡坦半抗原的合成方法及唑吡坦免疫檢測試劑對于唑吡坦的濫用快速檢測非常重要。目前，關(guān)于唑吡坦半抗原設(shè)計及快速檢測的方法尚未見報導(dǎo)，本文主要通過碳二亞胺法合成唑吡坦半抗原并制備唑吡坦（ZOL）免疫檢測試劑（膠體金法）。擬為唑吡坦的濫用快速檢測提供解決方案，從而服務(wù)于全球公共衛(wèi)生健康事業(yè)。

1 材料與方法

1.1 儀器，試劑

1.1.1 儀器

精 密 電 子 天 平MCE 1202S-2CCN-0（Sartorius），數(shù)顯加熱恒溫磁力攪拌器C-MAG HS7（IKA），超純水儀Milli-Q Advantage A10（Millipore），冷卻水循環(huán)器CCA-1111、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001（EYELA），臺式高速離心機(jī)ST16R，微量紫外-可見分光光度計NanoDrop 2000C（Thermo），干型透析袋44-14000D（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司），垂直電泳槽DYY-Ⅲ型（北京六一儀器廠），XYZ大平臺三維感應(yīng)劃膜噴金儀HM3260（上海金標(biāo)生物科技有限公司）。

1.1.2 試劑

唑吡坦（美國C & C公司），溴丁酸乙酯（Aladdin），牛血清蛋白（MW：67000），N-羥基琥珀酰亞胺、環(huán)己基碳酰二亞胺（Sigma），鼠抗唑吡坦單克隆抗體（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司），其他試劑均為廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 唑吡坦抗原合成

1.2.1 唑吡坦半抗原的合成

將唑吡坦 307.39 mg（1 mmol）溶于乙腈∶水（2∶1，V/V）15 mL中，用甲酸調(diào)至pH 5，在攪拌條件下，30～35 min內(nèi)逐滴滴加新制2 M KMnO4水溶液12 mL，密封RT反應(yīng)14 h。過濾，濾液調(diào)pH至7。用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用10 g無水硫酸鈉干燥12 h；有機(jī)相減壓蒸干，得到化合物A（269 mg）。將上述所得化合物A加入10 mL（C2H5）3N，414.63 mg K2CO3，20 mg KI，20 mg TBAB，292.57 mg溴丁酸乙酯，在He保護(hù)下，50 ℃反應(yīng)20 h；反應(yīng)體系降溫至室溫，在攪拌條件下加入20 mL水，用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用10 g無水硫酸鈉干燥12 h；有機(jī)相減壓蒸干，得到化合物B（202 mg）。

將上述所得化合物B加入10 mL乙醇和5 mL飽和氫氧化鋰溶液，40 ℃反應(yīng)4 h；反應(yīng)體系降溫至4 ℃左右，在劇烈攪拌條件下，5 min內(nèi)滴加10 mL水；待反應(yīng)體系溫度維持4 ℃后，1 M鹽酸調(diào)pH至3，用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用10 g無水硫酸鈉干燥12 h；有機(jī)相減壓蒸干，得到唑吡坦半抗原（162 mg）（4-（N-甲基-2-（6-甲基-2-（對甲苯基）咪唑[1，2-α]吡啶-3-基）乙酰胺基）丁酸）（結(jié)構(gòu)如圖1）。

圖1 唑吡坦半抗原

1.2.2 唑吡坦抗原的合成

在25 mL干燥單口瓶中，加入1 mmol唑吡坦半抗原、1.2 mmol N-羥基琥珀酰亞胺、1.2 mmol環(huán)己基碳酰二亞胺和8 mL N，N-二甲基甲酰胺，在氦氣保護(hù)下25 ℃下攪拌18 h。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物分裝8個1.5 mL離心管中，10 000 rpm離心30 min，將上清液（活性酯溶液）分裝在8個2 mL的玻璃密封瓶中氦氣保護(hù)下4 ℃儲藏備用。

取50 mg 牛血清蛋白溶解于8 mL 0.1 M pH7.0磷酸鹽緩沖液，維持反應(yīng)體系溫度在4 ℃左右，將2.6 mL活性酯溶液緩慢的滴加到牛血清蛋白-磷酸鹽溶液中，用0.05 M鹽酸隨時調(diào)整反應(yīng)液的pH，維持反應(yīng)體系的pH在7.0左右，維持反應(yīng)體系溫度4 ℃左右，攪拌反應(yīng)18 h；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋（截留分子量：14 000 D）中，用0.05 M pH7.0磷酸鹽緩沖液透析多次，用微量紫外-可見分光光度計進(jìn)行監(jiān)測，直至透析液在260 nm和280 nm吸光值與基線一致[11]，然后將反應(yīng)液凍干，得唑吡坦抗原：唑吡坦-牛血清蛋白[12]。

1.2.3 唑吡坦抗原的合成路線

圖2 合成路線

通過與蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成人工抗原，進(jìn)而使原本無免疫原性的化學(xué)分子獲得免疫原性是應(yīng)用于快速檢測分析的基礎(chǔ)，因此鑒定人工抗原是否合成成功是關(guān)鍵。本實驗通過紫外線光譜測定法，比較唑吡坦抗原與唑吡坦半抗原，BSA的紫外吸收曲線，從而證實唑吡坦抗原合成成功。再通過蛋白電泳證實唑吡坦抗原的分子量大于BSA，為唑吡坦抗原成功合成提供直接有利的證據(jù)。

1.3 唑吡坦抗原鑒定

1.3.1 紫外光譜法測定

紫外光譜法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理，分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度。在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜迭加的性質(zhì)。

分別測定上述唑吡坦半抗原、牛血清蛋白、上述唑吡坦抗原在190～300 nm紫外光譜掃描結(jié)果，對照三者的紫外吸光光譜特征可以進(jìn)行定性解析。檢測并分析三者的在某些波長處的吸光值，可說明是否偶聯(lián)成功抗原[13]。

1.3.2 蛋白質(zhì)電泳測定

按《現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)》[14]進(jìn)行操作，唑吡坦抗原取樣量10 μg。

1.3.3 活性檢測

用免疫層析法對唑吡坦抗原檢測。用劃膜噴金儀將唑吡坦抗原固定到硝酸纖維素膜上，與膠體金標(biāo)記的唑吡坦單克隆抗體，組裝成膠體金免疫層析分析試紙[15]，對試紙條進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 唑吡坦半抗原的合成鑒定結(jié)果

本研究選擇以唑吡坦分子結(jié)構(gòu)中胺基作為連接點，衍生出丁酸手臂作為蛋白載體連接點，最大限度保留唑吡坦的分子結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，唑吡坦半抗原合成成功[MW：378.2（M-1）]，見圖3。

圖3 唑吡坦抗原的ESI-MS分析圖譜

2.1.1 唑吡坦人工合成抗原的紫外掃描結(jié)果

唑吡坦半抗原、牛血清蛋白（BSA）及唑吡坦抗原的紫外掃描圖（如圖4所示），牛血清蛋白（BSA）在279 nm和252 nm處有典型吸收，唑吡坦半抗原和唑吡坦-牛血清蛋白偶聯(lián)物的吸收在279 nm和252 nm處有明顯的偏移，這說明該人工抗原偶聯(lián)物與唑吡坦半抗原有不同的紫外吸收特征，表明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功[16]。

圖4 唑吡坦半抗原、牛血清蛋白及唑吡坦抗原在PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）中的紫外光譜圖

2.1.2 唑吡坦合成抗原的蛋白質(zhì)電泳測定結(jié)果

2、3、4泳道：唑吡坦抗原；1、5泳道：Marker（從上向下分子量依次為116 kD β-galactosidase，66.2 kD Bovine serum albumin，45 kD Ovaibumin，35 kD Lactate dehydrogenase，25 kD REase Bsp98l，18.4 kD β-lactoglobulin，14.4 kD Lysozyme）；6泳道：牛血清蛋白

圖5 唑吡坦抗原蛋白質(zhì)電泳

由圖5可見，唑吡坦抗原平均色斑位于66 KD與116 KD之間，并高于67 KD牛血清蛋白。唑吡坦抗原分子量大于牛血清蛋白分子量，說明唑吡坦半抗原與牛血清蛋白偶聯(lián)成功。

2.2 抗原活性檢測

2.2.1 唑吡坦檢測用膠體金免疫層析分析試紙的制備

（1）膠體金-單抗結(jié)合物玻璃纖維條的制備

將膠體金標(biāo)記的唑吡坦單克隆抗體與10 mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混合，配制成濃度0.5 mg/mL的溶液，均勻涂布在玻璃纖維素紙上，涂布量為50 μL/cm，50 ℃干燥12 h。

（2）檢測線和質(zhì)控線的制備

檢測線（T線）：將唑吡坦抗原與0.01 M pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混合，配制成濃度0.2 mg/mL的溶液，用劃膜噴金儀固定在硝酸纖維素膜上。

質(zhì)控線（C線）：將羊抗鼠IgG多抗與10 mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混合，配制成濃度0.1 mg/mL的溶液，用劃膜噴金儀固定在硝酸纖維素膜上。

然后在50 ℃干燥12 h。

（3）膠體金免疫層析分析試紙的組裝

將濾樣紙、包被有膠體金標(biāo)記唑吡坦抗體的玻璃纖維素紙、包被有檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的硝酸纖維素膜、吸水紙依次搭接組裝成測試條，將測試條置于支撐板上，用膠固定，如圖6。

圖6 膠體金免疫層析分析試紙

2.2.2 唑吡坦檢測用膠體金免疫層析分析試紙的測試

（1）樣本配制

根據(jù)測試要求，在空白尿樣中添加唑吡坦標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成含唑吡坦的樣本，濃度為0 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL和75 ng/mL。

（2）檢測與結(jié)果

將上述系列濃度定量梯度測試，靈敏度實驗結(jié)果如表1。

表1 膠體金免疫層析分析試紙的靈敏度試驗結(jié)果

實驗結(jié)果表示，該試紙最低檢測量50 ng/mL。

（3）陰性樣本

根據(jù)測試要求，對經(jīng)過GC/MS分析測試后的臨床陰性樣本308例，分別加樣在唑吡坦檢測用膠體金免疫層析分析試紙上，結(jié)果均為陰性。綜上證明，唑吡坦抗原能與抗體匹配結(jié)合，由此證明合成的人工抗原具有抗原活性。

3 討論

唑吡坦，屬于非苯二氮?類催眠藥，其藥理是通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的GABAa受體氯通道，從而具有抗驚厥、抗焦慮和輕微的肌松弛作用，主要用于失眠患者的短期治療[17]。唑吡坦最初被認(rèn)為是一種比苯二氮?類更安全的藥物[18]，但越來越多的研究證明唑吡坦具有使機(jī)體耐受成癮的風(fēng)險[19]。同時，因濫用唑吡坦導(dǎo)致的精神疾病不斷被報道，后續(xù)戒斷也給醫(yī)護(hù)人員和患者帶來困難。早在2001年，WHO已經(jīng)將唑吡坦列為與苯二氮?類同等依賴風(fēng)險類別[20]，作為一種容易被濫用藥物，快速檢測唑吡坦濫用有助于世界公共衛(wèi)生健康事業(yè)。

與液相-質(zhì)譜儀等大型分析儀器相比，基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的免疫檢測方法具有操作簡單、成本低、高通量及靈敏準(zhǔn)確的優(yōu)點，適合應(yīng)用于多種環(huán)境下的藥物濫用的篩查[21]，幫助臨床醫(yī)生在病人床邊更快地獲得檢測結(jié)果[22]。然而，關(guān)于唑吡坦半抗原設(shè)計及快速檢測的方法尚未見報導(dǎo)，有必要研究與建立唑吡坦的快速免疫檢測方法。因唑吡坦分子量為307.39，分子量低于1 000的化合物不具有免疫原性，需對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定的修飾改造，才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相對應(yīng)的抗體。唑吡坦分子結(jié)構(gòu)中存在有苯環(huán)、羰基、胺基等可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的基團(tuán)，通過前期研究[23]，發(fā)現(xiàn)苯環(huán)和羰基修飾后，導(dǎo)致唑吡坦的分子空間結(jié)構(gòu)存在較大改變，不利于得到與特異性高的人工抗原。因此，本研究選擇以胺基作為連接點，引入具有羧基的活性手臂，再與載體偶聯(lián)制備成人工抗原得到唑吡坦的人工抗原。在小分子濫用藥物的免疫分析中，能否合成穩(wěn)定且具有良好免疫原性的人工抗原分子是制備抗體和建立免疫分析方法的最關(guān)鍵的步驟，需要對人工抗原進(jìn)行抗原活性檢測。本實驗表明，大于50 ng/ml的人工合成抗原可以與之匹配的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而可以證實唑吡坦人工合成抗原能夠有效刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生，具有抗原活性，為下一步開發(fā)免疫檢測產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

4 總結(jié)

本研究成功合成了唑吡坦半抗原及其人工抗原，該抗原具有較高的活性，且與唑吡坦抗體反應(yīng)表現(xiàn)出較高的特異性，為研究開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷的免疫檢測產(chǎn)品提供了方向性。但本實驗尚未設(shè)置干擾實驗來驗證唑吡坦人工合成抗原的抗干擾性；且對于一款可上市的膠體金檢測產(chǎn)品而言，需要通過人體臨床試驗來研究其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性及臨床可報告范圍等性能指標(biāo)。本實驗下一步將進(jìn)行人體臨床試驗，從而進(jìn)一步驗證在實際應(yīng)用中該唑吡坦合成抗原的可靠性。