清開靈、蓮必治分別聯(lián)合不同抗生素對ICU 耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的體外抑菌效果

劉 佳，陶慶春，李公民，趙玉玲，程麗娟，蔡潔新

（1.北京市房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，北京 102400；2 北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院檢驗科，北京 100029；3.北京燕化醫(yī)院檢驗科，北京 102500；4.北京良鄉(xiāng)醫(yī)院檢驗科，北京 102401；5.北京市房山區(qū)第一醫(yī)院檢驗科，北京 102400）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）是逃避抗菌藥物作用最嚴重的六大超級細菌之一[1]，也是重癥監(jiān)護病房（ICU）感染的主要致病菌。臨床上可引起傷口感染、敗血癥和呼吸機相關(guān)肺炎等疾病[2]。近年來耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（CRAB）的檢出率及耐藥率呈快速增長的趨勢，探索中西醫(yī)藥物聯(lián)合治療成為臨床研究熱點。目前治療鮑曼不動桿菌的首選抗生素分別為頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培南西司他丁鈉。清開靈注射液為中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)等作用[3]，還有一定的抑制革蘭陰性桿菌生長作用及聯(lián)合抗菌藥物治療細菌感染的效果[4]。蓮必治注射液是單一成分為穿心蓮內(nèi)酯的中藥注射劑，具有抗炎、抗病毒等作用[5，6]。本研究收集2019 年1 月～11 月北京市房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院、北京燕化醫(yī)院、北京良鄉(xiāng)醫(yī)院、北京市房山區(qū)第一醫(yī)院ICU 分離出的30株標本，分析清開靈、蓮必治注射液分別聯(lián)合四種抗生素對ICU 收集的30 株CRAB 菌株體外抑菌效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2019 年1 月～11 月北京市房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院、北京燕化醫(yī)院、北京良鄉(xiāng)醫(yī)院、北京市房山區(qū)第一醫(yī)院ICU 分離出的30 株標本，排除同一患者的同一部位重復(fù)送檢。通過全自動微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)確定為CRAB 菌株。

1.2 試驗藥物 清開靈清注射液10 ml/支（神威藥業(yè)集團有限公司，生產(chǎn)批號：180116D1）；蓮必治注射液5 ml/支（江蘇九旭藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：201907012）；頭孢他啶0.5 g/瓶（海南海靈化學制藥有限公司，生產(chǎn)批號：1906201）；頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉1.5 g/瓶（輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號：AX0181）；哌拉西林鈉他唑巴坦2.5 g/瓶（華潤雙鶴藥液股份有限公司，生產(chǎn)批號：Q1807301）；亞胺培南西司他丁鈉1.0 g/瓶（杭州默沙東制藥有限公司，生產(chǎn)批號：R023135）。

1.3 實驗儀器和設(shè)備 M-H 肉湯培養(yǎng)基（英國OXOID 公司）、Class ⅡBSC 生物安全柜（ESCO 公司）、VITEK2 Compact 全自動微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）、96 孔板。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌液配制 分別取經(jīng)分純的30 株CRAB 菌落，各用5 ml 生理鹽水配制成0.5 麥氏比濁菌液，再用MH 肉湯進行稀釋，保證加入96 孔板內(nèi)20 μl 菌液濃度是5×105CFU/ml。

1.4.2 藥物最低抑菌濃度（MIC）測定 清開靈、蓮必治最高濃度（原液）1000 μl/ml（1∶1），稀釋原液（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128），頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦及亞胺培南西司他丁鈉的最高濃度1024 μg/ml，四種抗生素分別用MH 肉湯稀釋至1024 μg/ml、512 μg/ml、256 μg/ml、128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml。最后，將不同濃度的藥液各取180 μl，菌液20 μl 加入至96 孔板搖勻。每組做空白和陽性對照，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察上述藥物分別對30 株CRAB 抑菌的MIC 結(jié)果。

1.4.3 聯(lián)合抑菌MIC 測定 根據(jù)上述藥物分別對30株試驗菌的MIC 值來確定2 倍MIC 最高稀釋濃度，將聯(lián)合應(yīng)用的兩種藥物的最高濃度分別倍比稀釋配制成8 個不同濃度30 組。采用棋盤稀釋法，每組橫排分別加入稀釋后不同濃度的清開靈，豎排為稀釋后不同濃度抗生素各90 μl，每孔加菌液20 μl 后搖勻，35 ℃培養(yǎng)24 h，記錄兩種藥物聯(lián)用時最佳抑菌組合各藥液的MIC 值，并計算抑菌濃度指數(shù)（FIC）指數(shù)。

1.4.4 結(jié)果判讀 FIC 指數(shù)=甲藥聯(lián)合的MIC／甲藥單用的MIC＋乙藥聯(lián)合的MIC/乙藥單用的MIC。FIC 指數(shù)≤0.5 表明兩藥聯(lián)合為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1 表明兩藥聯(lián)合為相加作用；1＜FIC＜2 表明兩藥聯(lián)用為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2 表明兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)錄入Excel 進行分析，計數(shù)資料以（n）和（%）進行描述。

2 結(jié)果

2.1 藥物單用及聯(lián)用的MIC 結(jié)果 蓮必治單用有1株抑菌濃度MIC 為1∶2，其余29 株MIC 均為1∶1。清開靈單用MIC 值范圍為1∶4～1∶2，見表1。聯(lián)用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的MIC50 和MIC90 分別是32、64 μg/ml，另外三種抗生素的MIC50、MIC90 均為64 μg/ml。清開靈聯(lián)合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的MIC50 降低最明顯，清開靈MIC50 降低1/8，頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉MIC50 降低2 倍，見表2。

表1 清開靈、蓮必治及四種抗生素單用對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的MIC 及菌株數(shù)量（n）

表2 清開靈及抗菌藥物單用及聯(lián)合應(yīng)用MIC 值范圍

2.2 清開靈聯(lián)合抗生素的菌株數(shù)量分析 清開靈1∶8+頭孢他啶64 μg/ml 菌株數(shù)量分布最多，占80.00%；清開靈1∶16+頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉32 和64 μg/ml、清開靈1∶8+頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉64 μg/ml菌株數(shù)量相同，占23.33%；清開靈1∶8+哌拉西林鈉他唑巴坦64 μg/ml 菌株數(shù)量最多，占46.67%；清開靈1∶8+亞胺培南西司他丁鈉64 μg/ml 菌株數(shù)量最多，占53.33%，見表3。

表3 不同濃度清開靈聯(lián)合四種抗生素的菌株數(shù)量（n）

2.3 聯(lián)合抑菌FIC 結(jié)果 由于蓮必治原液抑制CRAB濃度過高，未開展聯(lián)合試驗。清開靈分別聯(lián)合四種抗生素的FIC 協(xié)同作用范圍為13.33%～40.00%，相加作用范圍為46.66%～80.00%，無關(guān)作用范圍為6.67%～26.67%，拮抗作用均為0，見表4。

表4 清開靈聯(lián)合用藥的耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌FIC 結(jié)果[n（%）]

3 討論

隨著患者入住ICU 的時間延長及老年患者機體抵抗力下降等因素易造成CRAB 的感染出現(xiàn)多耐藥[7]，是臨床亟待解決的治療問題。中、西醫(yī)藥物聯(lián)合體外抑菌實驗結(jié)果證實[8]，中藥具有耐藥性低、多作用靶位的廣譜抗菌效果、抑菌效果明顯等優(yōu)點。清開靈注射液對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等有較強的抑制作用[9，10]。馬維娜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，清開靈對鮑曼不動桿菌有一定的抑制作用，與抗菌藥物聯(lián)用后表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用，抗菌藥物濃度降低可達到較好的抑菌效果，且與頭孢哌酮舒巴坦聯(lián)用后協(xié)同作用最明顯。蓮必治中的穿心蓮譽為“中藥抗生素”，穿心蓮內(nèi)酯提取物可抵抗流感病毒、輪狀病毒、皰疹病毒等，其療效較好、不良反應(yīng)少[12-14]，但穿心蓮注射液體外抑制CRAB 效果較差。

本研究中清開靈、頭孢他啶、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦、亞胺培南西司他丁鈉單用及聯(lián)合應(yīng)用的MIC 值范圍表明，清開靈注射液單獨應(yīng)用有很好的體外抑菌效果，其與四種抗生素藥物聯(lián)合應(yīng)用較各單用比MIC 范圍、MIC50、MIC90 均有明顯濃度降低，特別是與頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉聯(lián)合，清開靈的MIC 濃度降低16 倍、MIC50 降低8 倍，說明二者聯(lián)合抑菌時應(yīng)用藥物濃度劑量最少。不同濃度的清開靈與四種抗生素聯(lián)合應(yīng)用的菌株數(shù)量結(jié)果表明，清開靈1∶8+頭孢他啶64 μg/ml 菌株數(shù)量分布最多，占80.00%；清開靈1∶16+頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉32 和64 μg/ml、清開靈1∶8+頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉64 μg/ml 菌株數(shù)量相同，占23.33%；清開靈1∶8+哌拉西林鈉他唑巴坦64 μg/ml 菌株數(shù)量最多，占46.67%；清開靈1∶8+亞胺培南西司他丁鈉64 μg/ml 菌株數(shù)量最多，占53.33%，說明除頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉外，清開靈1∶8 時其余三種藥物的濃度均為64 μg/ml菌株數(shù)量所占比最多。通過計算FIC，結(jié)果顯示清開靈與四種抗生素的相加作用均達到了70.00%以上，其中頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉舒巴坦鈉作用最明顯。因此，清開靈與上述兩種藥物相加協(xié)同作用突出，效果較好。

綜上所述，蓮必治注射液單用未能顯示較好的體外抑菌作用，而清開靈注射液聯(lián)合頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、哌拉西林鈉他唑巴坦相加和協(xié)同作用明顯，對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌體外抑菌效果較好。因此，臨床制定治療CRAB 感染的聯(lián)合用藥方案可參考每種抗菌藥物的MIC 值選用具有相加和協(xié)同效應(yīng)的藥物，避免藥物之間出現(xiàn)拮抗無效作用。