哌拉西林雜質(zhì)及其制備方法研究

樊長瑩

（山東安舜制藥有限公司，山東樂陵 253611）

哌拉西林是一種人工合成的青霉素之一，具有廣泛抗菌譜的能效。哌拉西林在應用過程中常與他唑巴坦與舒巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑一起應用，在臨床中常用于含有β-內(nèi)酰胺酶耐藥細菌。在進行抗生素應用的過程中，盡管哌拉西林抗菌活性強，但是同樣需要在抗生素的應用前開展細菌學的培養(yǎng)，若是有細菌耐藥情況要按照藥物敏感進行實驗，隨時進行抗生素調(diào)整進行治療。

1 哌拉西林概述

哌拉西林化學名為（2S，5R，6R）-3，3-二甲基-6-[（R）-2-（4乙基-2，3二氧代-1-哌嗪甲酰胺基）-2-苯乙酰氨基]-3-氧代-4-硫雜-1-氮。分子量為517.66，分子式為C23H27N5O7S，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

1.1 哌拉西林的價值

哌拉西林是半合成氨脲芐類抗假單細胞菌青霉素，對于革蘭陽性菌、革蘭氏陰性菌在抗菌作用上極為明顯，最為重要的是，哌拉西林對于綠膿桿菌有明顯作用，在臨床中的應用較為廣泛。哌拉西林在對繁殖期細菌的滅殺效果明顯，但對靜止期細菌作用近無，所以藥理中哌拉西林主要作為繁殖期殺菌劑的抗菌藥物。哌拉西林對于人體而言，無較大副作用，是青霉素類抗生素過敏人群之外，多數(shù)人能夠安全使用的藥物。

1.2 哌拉西林生產(chǎn)路線

N-乙基雙氧哌嗪、三乙胺、三甲基氯硅烷、三光氣反應制備酰氯；之后酰氯和氨芐西林反應，制成粗品哌拉西林；將乙酸乙酯與水加入粗品哌拉西林之中，重視對反應溫度的控制；加入碳酸氫鈉，對pH進行調(diào)節(jié)；攪拌加速溶解，完全溶解后靜置分層；活性炭加入水層進行脫色處理；抽濾；對濾液加入乙醇和乙酸乙酯，控制在適宜溫度后滴加鹽酸，進行pH調(diào)節(jié)；攪拌一定時間后，得到成品哌拉西林。

1.3 哌拉西林生產(chǎn)存在的不足

精制之后得到的哌拉西林成品再經(jīng)過液相色譜檢測，相對保留的時間為RRT=1.75時，會出現(xiàn)未知的雜質(zhì)，但是這些雜質(zhì)的制備研究相對較少，對其結(jié)構(gòu)和毒性、分離、合成方法介紹也不明確、詳細。在工業(yè)生產(chǎn)中，哌拉西林得到未知雜質(zhì)的含量難以進行有效的控制，不能達成ICH指南要求中未知雜質(zhì)不能大于0.05%要求，對于產(chǎn)品質(zhì)量造成負面影響。因此，要使此類未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)和毒性得到確定，需要一種方法進行雜質(zhì)純品制備、結(jié)構(gòu)確定，進而使其毒性得到明確。

2 哌拉西林雜質(zhì)的制備

2.1 哌拉西林雜質(zhì)概述

為了使傳統(tǒng)哌拉西林在生產(chǎn)中的雜質(zhì)問題得到解決，進行哌拉西林雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的確認及制備。在本次發(fā)明中，對哌拉西林RRT=1.75未知雜質(zhì)進行合成與純化，對于所得純度超過99%的純品雜質(zhì)進行分析，以此使雜質(zhì)結(jié)構(gòu)得到明確，如圖2所示。該雜質(zhì)是哌拉西林和乙醇開環(huán)酯化反應后所得產(chǎn)物，沒有毒性。本次研究中對于哌拉西林RRT=1.75未知雜質(zhì)純品制備、結(jié)構(gòu)確認，能夠在哌拉西林雜質(zhì)的定量、定性分析中應用，對于哌拉西林工業(yè)生產(chǎn)中質(zhì)量控制有極為重大的意義。

圖2 哌拉西林雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

2.2 哌拉西林雜質(zhì)的制備方法

2.2.1 哌拉西林雜質(zhì)合成

將精制哌拉西林作為原材，使用碳酸氫鈉與水溶解，哌拉西林與碳酸氫鈉在質(zhì)量比上要為1∶（0.16～0.25），最佳為1∶0.18，水與乙醇體積比要為1∶0.8到1.2，1∶1最佳；溶解后加入乙醇進行溫度控制，溫度為20～45℃，并進行攪拌，攪拌時間要達到20～50h，最好為20～30h，使其充分反應；完成反應后滴加酸溶液進行pH調(diào)節(jié)，酸為鹽酸，要為2N到5N，pH為1.5～3.0，將析出產(chǎn)物抽濾；濾餅加水進行溶解，加熱溶解最佳，溶解后進行降溫并析出后，獲得粗品哌拉西林雜質(zhì)。

2.2.2 液相分離

色譜柱為Agient ZORBAX SB-CI8液相色譜柱，規(guī)格為150×4.6mm，5μm，選擇體積比為1∶1的水和乙腈，加入磷酸二氫鉀2.7g/L作流動相，流速則控制在40～60mL/min；對于得到的優(yōu)選哌拉西林雜質(zhì)樣品溶液實施液相色譜分離操作，優(yōu)選樣品溶液指取哌拉西林粗品1g，并加入30～50mL乙腈進行溶解，攪拌到完全溶解后，添加流動相直到100mL所得到的樣品溶液；液相分離中獲得雜質(zhì)含量不小于99%的雜質(zhì)溶液。

2.2.3 雜質(zhì)富集

對哌拉西林雜質(zhì)含量不小于99%的溶液進行有機溶劑萃取，萃取中使用的有機溶劑主要有乙酸乙酯和二氯甲烷中的一種；在有機相得到干燥劑的處理之后，干燥劑是無水硫酸鈉和無水硫酸鎂的一種或兩種混制；得到純度大于99%的雜質(zhì)結(jié)晶體。

3 實際實施過程

3.1 哌拉西林RTT1.75雜質(zhì)制備

例1：取500mL三口瓶，對其加入成品哌拉西林10g、水100mL、乙醇100mL、碳酸氫鈉8g、三口瓶在水浴鍋中放置，將溶液的溫度控制在25～30℃，將其攪拌15min，pH為7.97，溶液澄清，無固體。在攪拌達到25h后，溶液溫度為27℃，pH為8.67，滴加HC1溶液2N，對滴加速度進行控制，完成滴加后溫度為28℃，pH為1.96，進行攪拌1化之后進行抽濾，將得到的固體添加到250mL三口瓶中，并添加水100mL，使其升溫到80℃，再攪拌30min，0℃降溫冷卻攪拌1h之后，對其抽濾后，進行干燥處理。之后對固體液相檢測，雜質(zhì)純度達到了28.5%。

例2：取例1相同三口瓶，除碳酸氫鈉2.0g，其他條件相同。之將瓶放置在水浴鍋中，對溶液溫度進行控制，為30～35℃，對其進行攪拌，時間為15min，pH為7.28，溶液澄清，無固體。溫度為30～35℃的情況下攪拌30h，溶液溫度為31℃，pH為7.24，滴加HC1溶液2N，注意對滴加速度的控制。滴加完成后pH為2.48，攪拌1h后進行抽濾。取250mL三口瓶，將固體加入其中，并添加水100mL，提升溫度到80℃，進行攪拌30min后，再于0℃下降溫冷卻，之后攪拌1h，抽濾，干燥，對固體液相檢測后，雜質(zhì)純度僅20%

3.2 哌拉西林RRT1.75雜質(zhì)分離

在雜質(zhì)分離的過程中，液相色譜條件為：色譜柱為Agient ZORBAX SB-C18液相色譜柱，規(guī)格為150×4.6mm，5μm；進樣量為20μL；柱溫為25℃。

在進行流動流動相的配置中，使用2 000mL燒杯，對其加入精制用水100mL與磷酸二氫鉀5.4g，進行攪拌直到完全溶解，之后將色譜級乙腈1 000mL加入，攪拌均勻后等待使用。液相中，使用250mL燒杯將制備雜質(zhì)1.0g添加到其中，加入乙腈30～50mL，攪拌到完全溶解，后加入流動相，直至溶解達到100mL。流速為4mL/min的情況下展開雜質(zhì)分流，液相圖如圖3所示：峰三的位置進行取樣，分別為A3-1、A3-2、A3-3、A3-4、A3-5，經(jīng)過檢測后雜質(zhì)的純度均超過90%，重復以上檢測操作后，B3-1、B3-2、B3-3、B3-4、B3-5中B3-1純度為88.1%，其與均超過90%；C3-1、C3-2、C3-3、C3-4、C3-5中，雜質(zhì)純度均超過90%；D3-1、D3-2、D3-3、D3-4、D3-5，D3-1純度87.96%，其與雜質(zhì)純度均超過90%。對于四組雜質(zhì)純度超過90%的溶液進行合并，加入二氯甲烷500mL，并攪拌15min，之后將其靜置分層。分層之后，水層加入二氯甲烷100mL，攪拌15min后，靜置分層。進行有機層合并，將其置入1 000mL容量的三口瓶中，并添加無水硫酸鎂50g，并進行攪拌30min，抽濾，將得到的濾液轉(zhuǎn)入100mL單口瓶中，減蒸處理后獲得固體，通過液相檢測后明確RRT=1.5的雜質(zhì)純度達到99.18%，約計為100mL。

圖3 液相圖

3.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確認

根據(jù)得到的雜質(zhì)成分進行其結(jié)構(gòu)組成進行判斷，譜圖解析，如圖4所示。

圖4 哌拉西林雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

通過質(zhì)譜分析明確（M-H）-=562.1。通過譜圖解析中的數(shù)據(jù)來看，相比較哌拉西林而言，雜質(zhì)分子中分別多了一個-NH、-CH2、-CH3，化學位移來看是為CH3CH2-O，NH是四元環(huán)開環(huán)之后與N連接的氫分子，結(jié)合分子量為563.1、合成路線、哌拉西林結(jié)構(gòu)，確認哌拉西林在RRT=1.75時產(chǎn)生的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式為圖4，雜質(zhì)是為哌拉西林和乙醇開環(huán)酯化反應后所得產(chǎn)物，無毒性。

4 結(jié)束語

哌拉西林是現(xiàn)代臨床中的常用藥品，在生產(chǎn)中，靜置一定時間出現(xiàn)雜質(zhì)超標的現(xiàn)象，一定程度導致其生產(chǎn)成本增加。提出了哌拉西林雜質(zhì)制備方法及結(jié)構(gòu)確認，能夠為此提出解決途徑，一定程度上改善了哌拉西林工業(yè)生產(chǎn)中的質(zhì)量與成本。