超聲輔助提取花生紅衣中原花青素

黃武，李亞杰，亢帥，蒲云峰，侯旭杰*，郭芹，王強(qiáng)*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

花生紅衣是花生精深加工過程中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量較大，除用作動物飼料以外，在其他加工領(lǐng)域未得到有效利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花生紅衣中主要成分有水分（5%～9%）、蛋白質(zhì)（11%～18%）、脂肪（10%～14%）、粗纖維（37%～42%）、碳水化合物（12%～28%）、灰分（8%～12%）、單寧（7%）以及多種色素和硒、鋅、鈣、鉀、鐵等元素[1-2]。花生紅衣中多酚類物質(zhì)含量為90 mg/g～125 mg/g，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質(zhì)[3-4]，其中原花青素是在熱、酸條件下能產(chǎn)生花色素的一種無色物質(zhì)。原花青素是一種很強(qiáng)的抗氧化物質(zhì)，它在人體內(nèi)的抗氧化能力是維生素C的20倍，維生素E的50倍，可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑[7-8]。若能充分利用花生紅衣中的原花青素，將會獲得較可觀的經(jīng)濟(jì)效益[9]。

利用超聲波、微波破碎植物細(xì)胞壁，可有效提升植物中功效成分的提取效率[10-12]。尤其是超聲輔助提取技術(shù)在植物有效成分提取中有較為廣泛的應(yīng)用，在花生紅衣的活性成分提取方面也有相應(yīng)的研究，王菲等[13]、陳洋[14]、童愈元[15]、管文荻[16]用超聲輔助提取花生紅衣中原花青素；林櫻姬等[17]、任虹等[18]用超聲輔助技術(shù)對花生紅衣中多酚進(jìn)行提取，并取得較好的結(jié)果，證明此技術(shù)適用于花生紅衣活性成分的提取。因此，本研究在超聲輔助提取的基礎(chǔ)上，結(jié)合水浴浸提以提高提取效果，并用正交試驗(yàn)優(yōu)化原花青素的提取工藝，為花生紅衣這一副產(chǎn)物的高值化開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣：產(chǎn)地為山東，品種為四粒紅；無水乙醇、甲醇：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；香草醛（純度≥99%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；4%香草醛-甲醇溶液：精確稱取4.00 g香草醛用甲醇溶解并在100 mL容量瓶中定容；鹽酸：四川西隴化工有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：合肥博美生物公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（SHA-B）：江蘇金怡儀器科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-3000A）：上海亞榮生化儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器（SB-5200DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；微型旋渦混合儀（WH-3）：上海滬西分析儀器廠有限公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（EMS-20）：金壇市科順儀器廠；電子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高速冷凍離心機(jī)（TGL-20br）：上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見光分光光度計(jì)（UV-2450）：島津公司。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣中原花青素的提取方法

稱取干燥花生紅衣粉碎成粉末狀。用適量石油醚對紅衣粉末進(jìn)行脫脂：常溫下浸泡24 h，間歇攪拌，抽濾、烘干，得到花生紅衣脫脂粉末。精確稱取1.0 g脫脂后的花生紅衣粉末與乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)40%～80%）按比例[1∶20（g/mL）～1∶60（g/mL）]混合，在 30 ℃～70 ℃下超聲處理10 min～50 min。參考王菲等[13]的方法，將超聲處理后的樣液轉(zhuǎn)入30℃～70℃水浴浸提30 min～70 min。然后將得到的溶液在4 000 r/min條件下離心10min，將上層澄清液取出，用無水甲醇定容至100mL。從中吸取1 mL樣液，用無水甲醇定容至10 mL，得到原花青素樣品待測液[19-22]。數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)所得平均值。

1.3.2 原花青素提取率的測定

1.3.2.1 原花青素的測定方法

鹽酸-香草醛法測定原花青素：準(zhǔn)確吸取3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸于試管中，再吸取樣品液0.5 mL，迅速混勻，在避光條件下進(jìn)行20 min顯色反應(yīng)，測定吸光度[23]。

1.3.2.2 原花青素最大吸收波長的確定

精確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照鹽酸-香草醛法的條件反應(yīng)后，在紫外可見分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描，選擇最大吸收波長。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取50 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用無水甲醇于50 mL容量瓶定容，得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，之后分別稀釋成 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL（注：如由 1 mg/mL得到0.1 mg/mL稀釋液，取1 mL 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，再加入9 mL無水甲醇）這5個(gè)梯度，準(zhǔn)確量取0.5 mL各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入含3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸的混合液中，快速混勻，避光條件下反應(yīng)20 min，于500 nm波長下測定吸光度，空白對照為無水甲醇，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4 原花青素提取率的計(jì)算

適當(dāng)稀釋原花青素提取液，按照1.3.2.1中方法測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算出樣品中原花青素的質(zhì)量濃度（mg/mL），按照公式（1）計(jì)算出原花青素的提取率。

式中：C為原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為花生紅衣粉末質(zhì)量，g。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化花生紅衣中原花青素提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，選擇最佳工藝，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)L9（34）因素水平Table 1 Factor and levels of the orthogonal experiment L9（34）

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長選擇

在紫外可見分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描，原花青素最大吸收波長光譜圖見圖1。

圖1 原花青素最大吸收波長光譜圖Fig.1 Spectrogram of the maximum absorption wavelength of procyanidin

如圖1所示，選擇出最大吸收波長為500 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)原花青素標(biāo)品所測結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of procyanidins

原花青素其標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為：y=1.176x+0.007，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。式中：x為樣品中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；y為吸光度。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 水浴溫度對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴時(shí)間50 min，考察水浴溫度對原花青素提取效果的影響，見圖3。

圖3 水浴溫度對原花青素提取率的影響Fig.3 Influence of water bath temperature on extraction rate of procyanidins

如圖3所示，在30℃～50℃時(shí)提取率隨溫度升高而上升，50℃之后隨溫度上升提取率幾乎呈直線降低，原因可能是當(dāng)溫度超過一定數(shù)值時(shí)，原花青素結(jié)構(gòu)受到破壞，使提取率下降，且水浴溫度越高所需能耗越大。因此，最適水浴溫度選擇為50℃。

2.3.2 水浴時(shí)間對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，水浴溫度60℃，考察水浴時(shí)間對原花青素提取效果的影響，見圖4。

圖4 水浴時(shí)間對原花青素提取率的影響Fig.4 Influence of water bath time on extraction rate of procyanidins

如圖4所示，水浴時(shí)間在30 min～50 min期間，提取率隨時(shí)間增加而增加，時(shí)間達(dá)到50 min后，提取率隨時(shí)間變化不顯著，且略有下降趨勢。其原因可能是在水浴時(shí)間達(dá)到50 min后，原料中原花青素提取達(dá)到上限，因此提取率不隨時(shí)間增長而增長，同時(shí)浸提液中原花青素在60℃下發(fā)生少量分解使提取率略有降低。綜上所得，水浴時(shí)間為50 min最佳。

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30 ℃、水浴溫度60℃、水浴時(shí)間50 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取效果的影響，見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響Fig.5 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖5所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增高，原花青素提取率呈上升趨勢，在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后，提取率開始降低?？赡苁怯捎陔S乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，極性增大，原料中醇溶性和脂溶性成分溶出率增加，使原花青素與乙醇-水分子結(jié)合率降低，從而使原花青素提取率降低。另外，高濃度乙醇使原料中蛋白質(zhì)等生物大分子變性沉淀，使原花青素溶出阻力增大，降低提取效果。體積分?jǐn)?shù)在60%和70%時(shí)，提取率無顯著差異，綜合考慮，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.3.4 料液比對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度30℃、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間50min，考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）對原花青素提取效果的影響，見圖6。

圖6 料液比對原花青素提取率的影響Fig.6 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖6所示，原花青素提取效果隨料液比的增加呈先增大后降低趨勢，料液比為1∶40（g/mL）時(shí)提取率最高。隨著溶劑含量上升，溶質(zhì)不斷從原料中析出，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40（g/mL）時(shí)，溶質(zhì)析出呈最高水平，繼續(xù)增加溶劑則使原料中各種雜質(zhì)析出，使原花青素提取率下降，另外，原花青素含量一定時(shí)，溶劑體積增加使原花青素在溶液中濃度下降，使得提取率降低。因此，選擇料液比為1∶40（g/mL）最佳。

2.3.5 超聲溫度對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、水浴溫度60℃、水浴時(shí)間50 min，考察超聲溫度30、40、50、60、70℃對原花青素提取效果的影響，見圖7。

如圖7所示，原花青素提取率隨溫度變化趨勢為先升高后降低，在40℃時(shí)達(dá)到最高。其原因可能是，溫度升高，分子動能增大，原花青素快速大量溶出；溫度過高，部分原花青素被破壞，使提取率降低。由此確定最佳超聲溫度為40℃。

圖7 超聲溫度對原花青素提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of proanthocyanidins

2.3.6 超聲時(shí)間對原花青素提取率的影響

稱取1 g脫脂花生紅衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度40℃、水浴溫度 60 ℃、水浴時(shí)間 50 min，考察超聲時(shí)間 10、20、30、40、50 min對原花青素提取效果的影響，見圖8。

圖8 超聲時(shí)間對原花青素提取率的影響Fig.8 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins

如圖8所示，原花青素提取率在超聲時(shí)間為20min時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)原花青素已基本提取完全。超聲處理時(shí)間過長，可能導(dǎo)致原花青素結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)，原花青素長時(shí)間暴露空氣中易受氧化，使提取率下降。且長時(shí)間超聲處理，增加能耗，延長提取周期，增加提取成本，因此20 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。探究各因素對原花青素提取效果的影響情況，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

如表3所示，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)因素對原花青素提取率的影響都不顯著。究其原因可能是本例試驗(yàn)誤差過大且誤差自由度小（僅為2），使檢驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對提取率的影響都不顯著，因此不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較?？芍苯舆M(jìn)行直觀分析。直觀分析法又稱極差分析方法，通過比較各因素水平極差的大小，確定各因素主、次地位及最佳水平，極差越大，對原花青素提取率的影響越大[24]。如表2所示，極差分析結(jié)果表明，在ABCD這4個(gè)因素中，影響主次為C＞D＞A＞B，說明超聲時(shí)間（C因素）對原花青素提取率的影響最大，占影響因素43.38%，其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（D因素），占影響因素28.68%，料液比（A因素）和超聲溫度（B因素）影響較少，分別占17.65%和10.29%。最優(yōu)條件為 A3B1C1D2，即料液比為 1∶45（g/mL）、超聲溫度 35℃、超聲時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)得到原花青素提取率平均值為9.07%。與正交試驗(yàn)最優(yōu)組結(jié)果相比有所增加，因此所得最佳提取工藝具有參考價(jià)值。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 各因素結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the results of various factors

3 結(jié)論

本研究在經(jīng)過超聲波輔助提取后，再利用水浴浸提進(jìn)一步提高提取效果，并用正交試驗(yàn)對原花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。綜合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，最終確定各因素對原花青素提取效果的影響主次依次為：超聲時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲溫度；最佳提取條件為：超聲時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比 1∶45（g/mL）、超聲溫度 35℃、水浴溫度50℃、水浴時(shí)間50 min。在此條件下，原花青素最大提取率為9.07%，試驗(yàn)結(jié)果較單獨(dú)使用超聲提取或水浴浸提皆有所提高。本研究為花生紅衣這一副產(chǎn)物高質(zhì)化利用提供一定參考依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。