梅奇酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)火龍果酒風(fēng)味的影響

李凱婭，毛曦慶，林雪，劉四新，李從發(fā)*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570100；2.海南大學(xué)理學(xué)院，海南 海口 570100）

近年來(lái)火龍果（Hylocereus undulatus Britt）因其美麗的果形、鮮艷的色澤、獨(dú)特的口感以及高營(yíng)養(yǎng)、低熱值等鮮明特色而產(chǎn)銷(xiāo)兩旺，深受歡迎[1-2]。同時(shí)圍繞其開(kāi)展的深加工品類(lèi)也不斷涌現(xiàn)，其中以紅肉火龍果為原料而發(fā)酵制成的火龍果酒，更是因其較好地保留了其營(yíng)養(yǎng)成分和天然、艷麗的紫紅色澤，幾乎成為果酒家族的“新寵”[3-4]。然而如何使其酒香如其色澤一樣突出，真正彰顯其果香和發(fā)酵香兼?zhèn)涞纳铣似焚|(zhì)，卻是一個(gè)值得深入研究的課題。一般果酒發(fā)酵常采用發(fā)酵能力強(qiáng)的釀酒酵母菌種，但釀酒酵母一般產(chǎn)香能力有限，且因發(fā)酵旺盛易使果酒酒體單薄、風(fēng)味欠佳。近年來(lái)非釀酒酵母在發(fā)酵果酒中廣泛應(yīng)用，因其對(duì)風(fēng)味等感官特性的積極貢獻(xiàn)而越來(lái)越受到重視[5]。Andorrá等[6]認(rèn)為非釀酒酵母在果酒發(fā)酵中可以酶解釋放香味物質(zhì)和芳香化合物，有助于成品葡萄酒的感官更豐富完美。Philippe等[7]報(bào)道戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）在發(fā)酵中能生成更多的丙酸乙酯、異丁酸乙酯和二氫肉桂酸乙酯。MU?OZ等[8]發(fā)現(xiàn)雪利酒陳釀過(guò)程中高級(jí)醇的生成量與酵母菌菌種有關(guān)，貝酵母F12釀造的雪利酒比用釀酒酵母G1釀造的高級(jí)醇含量低。Moreira等[9]發(fā)現(xiàn)與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母混合發(fā)酵能減少高級(jí)醇和重硫酸鹽產(chǎn)量，增加乙酸異戊酯和乙酸乙酯的含量?？傊轻劸平湍竻⑴c的果酒發(fā)酵，不僅能增加果酒中的香味物質(zhì)，而且對(duì)降低高級(jí)醇含量也有十分重要的意義。本課題組前期研制火龍果酒時(shí)發(fā)現(xiàn)其高級(jí)醇含量稍偏高，不利于酒體協(xié)調(diào)和清爽，本研究首次引入非釀酒酵母進(jìn)行火龍果酒的混合發(fā)酵制備，探討其與單菌種發(fā)酵的差異效果，同類(lèi)研究未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)前期篩選，發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)香能力較強(qiáng)的梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3在菠蘿酒發(fā)酵改善香氣方面效果不錯(cuò)[10]，本文擬選其與商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254進(jìn)行混合發(fā)酵，以期釀制出風(fēng)味良好、高級(jí)醇含量低、色香味齊美的火龍果酒，為火龍果產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效、延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果（金都一號(hào)品系）：海南省東方市種植基地。

梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3：分離自番木瓜果皮，保存于海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院菌種保藏中心；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254：活性干酵母，購(gòu)自上海杰兔工貿(mào)有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基：2.0%葡萄糖、1.0%酵母膏、0.5%蛋白胨，自然pH值，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限公司；氣相色譜儀（Agilent7890A）：安捷倫科技有限公司；pH 計(jì)（PB-10）、手持糖度儀（PAL-1）：廣州市授科儀器科技有限公司；便攜式密度計(jì)（DA-130N）：深圳?？迫饍x器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果酒釀造基本工藝流程

火龍果→榨汁→酶解→成分調(diào)整→SO2處理→接種酵母菌→發(fā)酵→澄清、過(guò)濾、離心→分裝→分析、感官評(píng)定

1.3.2 菌種活化和培養(yǎng)

非釀酒酵母P3-3：將斜面菌種接入酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基、25℃振蕩、活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)二代、備用；釀酒酵母D254：按說(shuō)明方法，將活性干酵母40℃活化培養(yǎng)30 min。為使后續(xù)方法一致，將其接入酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，然后同P3-3一樣進(jìn)行二代活化培養(yǎng)。

1.3.3 火龍果酒的制備工藝

火龍果原汁（pH 4.20、糖度 17.0°Birx）中首先添加60 mg/L焦亞硫酸鈉溶液靜置2 h，然后置40℃水浴中以果膠酶處理3 h使之酶解。以檸檬酸調(diào)整pH值至3.70±0.05，以市售白砂糖調(diào)整糖度至23°Birx左右。統(tǒng)一處理好的果汁原料以500 mL裝液量分裝到1L錐形瓶中備用。

1.3.4 兩種酵母菌的接種比例

兩種酵母菌接種比例見(jiàn)表1。

表1 兩種酵母菌接種比例Table1 Ratio of two yeast inoculations

1.3.5 火龍果酒常規(guī)理化分析

可溶性固形物測(cè)定：手持糖度計(jì)法；總酸含量測(cè)定：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[11]；酒精度測(cè)定：DA-130N便攜式密度計(jì)法。

1.3.6 高級(jí)醇的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.3.7 揮發(fā)性香氣成分測(cè)定

火龍果酒的揮發(fā)性成分分析，采用頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）提?。òl(fā)酵完成后存放30 d的樣品），氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。根據(jù)文獻(xiàn)CHEN等[13]的方法測(cè)定，稍作修改。毛細(xì)管柱為 DB-wax（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），進(jìn)樣溫度260 ℃；模式：不分流；流量：1 mL/min；柱溫：40℃保持5 min，以5℃/min升至220℃，以20℃/min升至250℃，保持2.5 min；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃。

SPME的條件為萃取頭：65 μm PDMS/DVB 1 cm；溫度：50℃；時(shí)間：振蕩15 min，萃取 30 min；振蕩速度：250 r/min；解吸時(shí)間：5 min；GC 循環(huán)時(shí)間：45 min。樣品中加入內(nèi)標(biāo)（2-甲基-3-庚酮）進(jìn)樣。

1.3.8 感官評(píng)定

參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]進(jìn)行適當(dāng)修改，如表2。

表2 火龍果酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Pitaya wine sensory evaluation standards

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析。用Simca-P13.0進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析；采用繪圖軟件Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合發(fā)酵對(duì)火龍果酒常規(guī)理化指標(biāo)的影響

對(duì)梅奇酵母P3-3和釀酒酵母D254采用不同比例進(jìn)行同時(shí)接種的混合發(fā)酵研究。發(fā)酵期間的常規(guī)理化指標(biāo)見(jiàn)圖1。

由圖1可知，CI-Ⅰ組和D254單菌接種組的糖度和酒精度無(wú)明顯差異，但CI-Ⅲ組和P3-3的pH值明顯低于CI-Ⅰ組、CI-Ⅱ組和D254組?？偹嵩诎l(fā)酵8 d以后含量相對(duì)較高，但波動(dòng)較大，說(shuō)明該梅奇酵母產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、特別是產(chǎn)有機(jī)酸（如醋酸類(lèi)、多羧酸類(lèi)等）能力較強(qiáng)，這與其后續(xù)風(fēng)味特征也有關(guān)聯(lián)性[10]。

圖1 混合發(fā)酵體系中糖度、酒精度、總酸、pH值的變化趨勢(shì)Fig.1 Changes in brix，alcohol content，total acidity and pH value of pitaya wines during mixed fermentation

2.2 混合發(fā)酵對(duì)火龍果酒高級(jí)醇生成量的影響

高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)是構(gòu)成果酒風(fēng)味的一部分，但異丁醇和異戊醇類(lèi)的高級(jí)醇含量過(guò)高時(shí)常常會(huì)有上頭、頭重之類(lèi)的表現(xiàn)[14-15]。一般高級(jí)醇中正丙醇、異丁醇和異戊醇3種醇類(lèi)可占總高級(jí)醇的90%[12]。3種高級(jí)醇含量見(jiàn)圖2。

圖2 混合發(fā)酵火龍果酒高級(jí)醇產(chǎn)生量比較Fig.2 Comparison of higher alcohol production in pitaya wines by mixed fermentation

由圖2可知，P3-3發(fā)酵的正丙醇含量顯著高于其它組別，混合發(fā)酵的3組之間無(wú)顯著差異；CI-Ⅰ組的異丁醇含量最低為45.7 mg/L，顯著低于其它組別；所有組的異戊醇含量無(wú)顯著差異?？偢呒?jí)醇含量方面，CI-Ⅰ組和CI-Ⅱ組間無(wú)顯著差異，但都顯著低于其它組別。其中CI-Ⅰ組總高級(jí)醇含量比D254組降低11.9%，比P3-3組降低11.2%。顯示兩種酵母菌1∶1比例同時(shí)接種進(jìn)行混合發(fā)酵的高級(jí)醇含量最低，說(shuō)明非釀酒酵母參與的果酒發(fā)酵在控制高級(jí)醇含量方面具有積極作用。

2.3 感官評(píng)價(jià)

對(duì)發(fā)酵終止且陳釀一個(gè)月的火龍果酒，組織10人感官評(píng)定小組（4男6女）進(jìn)行逐一感官評(píng)定，見(jiàn)圖3。

圖3 火龍果酒的感官評(píng)分Fig.3 Sensory scores of pitaya wines

由圖3可知，CI-Ⅰ組感官評(píng)分最高，發(fā)酵的火龍果酒悅目協(xié)調(diào)、有濃郁的酒香，酒體豐滿，具有典型性。

2.4 揮發(fā)性香氣成分分析

香氣是決定最終果酒產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素[16]。通過(guò)固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，SPMEGC-MS）對(duì)感官評(píng)分最高的CI-Ⅰ組的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組分別檢測(cè)出118、111、116種揮發(fā)性物質(zhì)，顯示CI-Ⅰ組具有較好的揮發(fā)性物質(zhì)豐度。

表3 火龍果酒中的主要揮發(fā)性物質(zhì)Table 3 The main volatile compounds in pitaya wines

火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的比較圖見(jiàn)圖4。

由圖4可知，酯類(lèi)在CI-Ⅰ組中相對(duì)含量為17.1%，P3-3組為15.03%，D254組為15.12%，表明CI-Ⅰ組酯類(lèi)相對(duì)含量最高。酯類(lèi)種類(lèi)方面，混合發(fā)酵CI-Ⅰ組生成更多種類(lèi)的酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)，擁有D254組和P3-3組特有的酯類(lèi)物質(zhì)（如異丁酸乙酯和乙酸異戊酯），產(chǎn)生較低的可以釋放不愉快的蠟味物質(zhì)（十六酸乙酯）和醚味物質(zhì)（十四烷酸乙酯）。產(chǎn)生水果味的酯類(lèi)含量最高，主要有異丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯丙酸乙酯等。這可能是由于非釀酒酵母P3-3具有β-葡萄糖苷酶活力，可以水解糖苷鍵釋放香味物質(zhì)為火龍果酒增香。這與Clemente-Jimenez等[17]、Hu 等[18]和 Sun 等[19]的研究結(jié)果一致。

圖4 火龍果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的比較Fig.4 Comparison of volatile compounds in pitaya wines

火龍果酒中揮發(fā)性酸的含量和數(shù)量均低于醇類(lèi)和酯類(lèi)，代表性物質(zhì)為辛酸和乙酸。CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組揮發(fā)性酸相對(duì)含量分別為4.57%、4.42%、4.86%，無(wú)明顯差異。CI-Ⅰ組的醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量和D254組無(wú)明顯差異，但P3-3醇類(lèi)含量和相對(duì)含量較低，這可能是由于非釀酒酵母產(chǎn)醇能力弱而導(dǎo)致。揮發(fā)性酚對(duì)果酒的香氣和風(fēng)味產(chǎn)生不利影響[20]，混合發(fā)酵CI-Ⅰ組含有較低的4-乙基-2-甲氧基苯酚和2，4-二叔丁基苯酚等揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)，對(duì)火龍果酒的風(fēng)味具有積極的作用。

2.5 主成分分析（principal component analysis，PCA）

對(duì)3個(gè)組別的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，共獲得2個(gè)主成分，混合發(fā)酵火龍果酒PCA得分圖見(jiàn)圖5。

圖5 混合發(fā)酵火龍果酒PCA得分圖Fig.5 PCA score chart of pitaya wines by mixed fermentation

為獲得導(dǎo)致這種顯著差異的代謝物信息，進(jìn)一步采用最小二乘方判別分析（PLS-DA）對(duì)兩組樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PLS-DA得分圖見(jiàn)圖6。

圖6 混合發(fā)酵火龍果酒PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score chart of pitaya wines

進(jìn)一步采用有監(jiān)督式方法OPLS-DA進(jìn)行建模分析，結(jié)果得到2個(gè)主成分和1個(gè)正交成分。OPLS-DA得分圖如圖7所示。

圖7 混合發(fā)酵火龍果酒OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score chart of pitaya wines by mixed fermentation

各組發(fā)酵的火龍果酒均處于置信區(qū)間內(nèi)，3組樣本均有明顯的樣本聚集區(qū)，且組間的差異顯著大于組內(nèi)差異，表明單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵之間揮發(fā)性成分差異顯著。進(jìn)一步采用最小二乘方判別分析（PLS-DA）對(duì)兩組樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用OPLS-DA模型的VIP（VIP scores>1）值，并結(jié)合 t-test的 P 值（P<0.05）來(lái)尋找得到主要差異性表達(dá)代謝物主要有：壬酸、己酸、2，4-二羥基苯甲酸、苯丙酸乙酯、辛酸異戊酯、十一酸乙酯、苯甲酸乙酯、己酸己酯、2-癸醇、2-庚醇、壬醛。

3 結(jié)論

采用同時(shí)接種M.agaves P3-3與S.cerevisiae D254的方式混合發(fā)酵釀造火龍果酒，研究了混合發(fā)酵方式對(duì)火龍果酒高級(jí)醇含量和揮發(fā)性物質(zhì)的影響。各組常規(guī)理化指標(biāo)顯示無(wú)明顯差異，混合接種火龍果汁且菌種比例為1∶1時(shí)，可以明顯降低火龍果酒中高級(jí)醇含量，含量為183.10 mg/L，分別比D254、P3-3單菌發(fā)酵組降低11.9%、11.2%。CI-Ⅰ組感官評(píng)分最高，為88.9分。SPME-GC-MS結(jié)果顯示：CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組分別檢測(cè)出118、111、116種揮發(fā)性物質(zhì)，其中CI-Ⅰ組產(chǎn)生水果味酯類(lèi)含量最高，酯類(lèi)相對(duì)含量占比最高為17.1%，酯類(lèi)種類(lèi)最多，含有較低物質(zhì)濃度的揮發(fā)性酚類(lèi)物質(zhì)。可見(jiàn)，同時(shí)接種M.agaves P3-3與S.cerevisiae D254且接種比例為1∶1的方式能降低火龍果酒的高級(jí)醇含量，增加香氣物質(zhì)種類(lèi)并減少不愉快氣味的產(chǎn)生，使得火龍果酒悅目協(xié)調(diào)、酒體豐滿，具有典型性。對(duì)CI-Ⅰ組、D254組、P3-3組的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行差異分析，差異代謝物主要是酯類(lèi)物質(zhì)。