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    金針菇源維生素D2復(fù)合片劑對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)、骨及臟器影響

    2021-06-19 00:22:16胡代花楊旭陳旺馮自立張嘉昕李翠麗隋香菊祁珊珊雒志恒
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:骨組織臟器骨質(zhì)疏松癥

    胡代花,楊旭,陳旺,馮自立,張嘉昕,李翠麗,隋香菊,祁珊珊*,雒志恒

    (1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中 723000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨骼疾病,主要特征為低骨量和骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)退變,易導(dǎo)致骨脆性增加和骨折的發(fā)生。婦女絕經(jīng)后因卵巢功能衰退,血液及組織內(nèi)的雌激素水平大幅降低,破骨細(xì)胞活躍程度增強(qiáng),骨轉(zhuǎn)化率加快,骨吸收大于骨形成,引發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,PMOP發(fā)病率高達(dá)60%~70%,嚴(yán)重威脅患者的健康和生活質(zhì)量[1-3]。

    維生素D2(VD2)作為維生素D家族的重要一員,與維生素D3(VD3)具有相近的生物功能,均能調(diào)節(jié)鈣磷的代謝,促進(jìn)骨骼的健康,在臨床上用于預(yù)防和治療佝僂病、骨質(zhì)軟化、骨質(zhì)疏松等疾病[4-6]。人體自身不能合成VD2,需通過(guò)食物補(bǔ)充。高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用菌中不含VD2或含量極低,但卻含有較高的VD2前體——麥角甾醇[7-8]。在紫外照射下,食用菌中麥角甾醇發(fā)生B環(huán)開(kāi)環(huán)生成VD2前體,再經(jīng)1,7-氫遷移和重排周環(huán)反應(yīng)生成VD2。食用菌通過(guò)紫外輻照處理,其VD2含量大幅度提高[10-18],可作為補(bǔ)充VD的食品及藥品的重要天然原料。關(guān)于高含量VD2食用菌的體內(nèi)生物利用率,文獻(xiàn)多對(duì)正常大鼠或缺乏VD人群補(bǔ)充不同劑量的紫外照射食用菌,從血清Ca2+濃度、25-羥基-VD2含量、甲狀旁腺激素表達(dá)水平、股骨密度、脛骨厚度、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因在十二指腸和腎臟中的表達(dá)等指標(biāo)進(jìn)行研究,結(jié)果表明通過(guò)紫外照射提高VD2含量的食用菌具有較好的生物利用度[19-24],但有關(guān)其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

    為了進(jìn)一步明確高含量VD2食用菌對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果,本文以去雙側(cè)卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型,以所研制的金針菇源VD2復(fù)合片劑為材料,比較大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,StrACP)等生化指標(biāo)及臟器指數(shù)、子宮和骨組織等形態(tài)病理學(xué)指標(biāo)變化,旨在為食用菌源VD2產(chǎn)品的研發(fā)及高值化應(yīng)用,以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和重要參考。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    Nikon Ti倒置熒光顯微鏡:尼康光學(xué)儀器有限公司;BIOTEK EPOCH酶標(biāo)儀:美國(guó)博騰儀器有限公司;1200紫外分光光度計(jì):島津儀器有限公司;RM2235石蠟組織切片機(jī):萊卡顯微系統(tǒng)有限公司;YT-7C攤烤片機(jī):孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司;5424型低速離心機(jī):德國(guó)Eppendorf有限公司;ZNCL-BS磁力攪拌器:常州梅香儀器有限公司;BSA224S-CW電子天平:賽多利斯儀器有限公司;DHP-200電熱恒溫培養(yǎng)箱:河北大宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

    VD2滴丸:國(guó)藥控股星鯊制藥有限公司;金針菇源VD2復(fù)合片劑:陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所自制;微板法鈣試劑盒、磷鉬酸法磷測(cè)試盒、堿性磷酸酶試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒:南京建成生物工程研究所。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康雌性3月齡未孕SD大鼠24只,由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重210 g~258 g,分籠飼養(yǎng),自由飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3 雙側(cè)卵巢去除手術(shù)

    將24只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)和去卵巢組(OVX組),其中Sham組6只,OVX組18只。OVX組大鼠參考文獻(xiàn)方法實(shí)施卵巢去除手術(shù)[25-26]。Sham組大鼠實(shí)施假手術(shù),術(shù)后1周對(duì)OVX組大鼠進(jìn)行陰道涂片,連續(xù)5 d,觀察去卵巢組不出現(xiàn)動(dòng)情周期,表明卵巢去除成功。

    1.4 動(dòng)物分組及給藥

    手術(shù)后1周,對(duì)OVX組進(jìn)行分組,分別是OVX+市售 VD2組(OVX+VD2組)、OVX+金針菇源 VD2復(fù)合片劑組(OVX+MVHP組)和OVX組,每組6只。其中Sham組每只大鼠每次灌胃1 mL純花生油;OVX組每只大鼠每次灌胃1 mL純花生油;OVX+VD2組每只大鼠每次灌胃含市售VD2滴劑的花生油(15 IU/mL)1 mL;OVX+MVHP組每只大鼠每次灌胃含金針菇源VD2復(fù)合片劑的花生油(15 IU/mL)1 mL。隔天灌胃,持續(xù)給藥16周。

    1.5 臟器指數(shù)測(cè)定

    連續(xù)給藥16周后將大鼠處死并稱重,打開(kāi)大鼠腹腔,取出大鼠心臟、肝、脾、腎和子宮等臟器分別進(jìn)行稱重,計(jì)算各臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重/大鼠體重。

    1.6 血清生化指標(biāo)測(cè)定

    連續(xù)給藥16周后采集大鼠眼眶靜脈血,4000r/min離心10 min,分離血清,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清鈣含量、血清磷含量、血清堿性磷酸酶活性、抗酒石酸酸性磷酸酶活性測(cè)定參考試劑盒方法進(jìn)行。

    1.7 骨組織樣品采集及病理學(xué)分析

    連續(xù)給藥16周后處死動(dòng)物,取其左側(cè)脛骨和股骨,3.7%多聚甲醛4℃固定24 h,磷酸鹽緩沖液漂洗,10%乙二胺四乙酸(pH 8.0)4℃,脫鈣21 d。將脫鈣標(biāo)本以磷酸鹽緩沖液充分漂洗,依次脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片(5 μm),蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)。顯微鏡觀察各組大鼠骨組織形態(tài)[26]。

    1.8 子宮病理組織形態(tài)學(xué)觀察和形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)

    取各組大鼠右側(cè)子宮角組織,依次脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片(5 μm),HE 染色。光學(xué)顯微鏡 4×10倍鏡下觀察子宮管徑厚度,10×10倍鏡下觀察子宮固有層腺體數(shù)量,40×10倍鏡下觀察子宮黏膜上皮厚度,并分別隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照保存,應(yīng)用Image Pro Plus軟件對(duì)子宮管徑厚度、子宮黏膜上皮厚度進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定[26]。

    1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

    試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Tukey’s HSD進(jìn)行方差分析(p<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 血清鈣和磷含量測(cè)定結(jié)果

    各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清鈣和磷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 不同處理組大鼠血清鈣和磷濃度(n=6)Fig.1 Serum calcium and phosphorus concentrations in rats in different treatment groups(n=6)

    圖1結(jié)果表明,與OVX組相比,OVX+MVHP組血清鈣濃度顯著升高(p<0.05)。Sham 組、OVX+VD2組血清鈣濃度與OVX組、OVX+MVHP組均無(wú)顯著差異(p>0.05);與OVX組相比,Sham組、OVX+MVHP組血清磷濃度均無(wú)顯著差異(p>0.05),而OVX+VD2組血清磷濃度顯著下降(p<0.05)。

    2.2 血清AKP與StrACP活性測(cè)定結(jié)果

    各實(shí)驗(yàn)組血清AKP與StrACP活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠血清中AKP、StrACP測(cè)量結(jié)果(n=6)Table 1 The AKP and StrACP in rats seurm of different groups(n=6)

    表1結(jié)果表明,Sham組、OVX+VD2組和OVX+MVHP組血清中AKP活性與OVX組相比均顯著降低(p<0.05),但各組血清StrACP活性與OVX組相比均無(wú)顯著差異(p>0.05)。OVX+VD2組和OVX+MVHP組血清StrACP活性與Sham組相比均顯著降低(p<0.05),但二者之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。

    2.3 臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

    各組大鼠主要臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果如表2所示。

    表2 各組大鼠臟器指數(shù)結(jié)果比較(n=6)Table 2 The major organ index of rats in different groups after operation(n=6)

    與OVX組相比,OVX+MVHP組肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、子宮指數(shù)顯著升高(p<0.05),心臟指數(shù)顯著降低(p<0.05),而脾臟指數(shù)無(wú)顯著差異(p>0.05)。與OVX+VD2組相比,OVX+MVHP組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、子宮指數(shù)顯著降低(p<0.05),腎臟指數(shù)顯著升高(p<0.05),而心臟指數(shù)無(wú)顯著差異(p>0.05)。

    2.4 子宮組織病理學(xué)觀察

    子宮組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。

    如圖2所示,Sham組大鼠子宮斷面結(jié)構(gòu)在光鏡下主要呈現(xiàn)壁厚腔窄的形態(tài),單層柱狀上皮規(guī)則排列,子宮肌層較厚,各層肌纖維相互交織,固有層分布有腺體和血管。與Sham組相比,OVX組子宮管徑厚度明顯變薄,子宮腔徑厚度也明顯增加,子宮黏膜上皮厚度明顯變小,固有層子宮腺體減少;與OVX組相比,OVX+VD2組和OVX+MVHP組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度明顯增加,子宮腔徑厚度明顯減小,肌層和子宮內(nèi)膜顯著增厚,固有層子宮腺體增多。

    圖2 子宮組織病理形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Histopathological observation of uterus of rats in different groups

    2.5 子宮形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果

    子宮組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果如表3所示。

    表3 各組大鼠子宮形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果比較(n=6)Table 3 The measurements of uterine morphometric indicators in rats of different groups(n=6)

    與Sham組相比,OVX組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著降低(p<0.05),子宮腔徑厚度顯著升高(p<0.05);與OVX組相比,OVX+MVHP組子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著升高(p<0.05),而子宮腔徑厚度顯著降低(p<0.05);OVX+MVHP組與OVX+VD2組子宮管徑厚度、子宮黏膜上皮厚度及子宮腔徑厚度均無(wú)顯著差異(p>0.05)。

    2.6 骨組織病理學(xué)觀察

    骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖3所示。

    圖3 各組大鼠脛骨和股骨病理學(xué)觀察Fig.3 Pathological observation of femora and tibia of rats in different groups

    Sham組股骨的骨小梁致密且較寬、排列整齊并連接成網(wǎng);與Sham組相比,OVX組股骨的骨小梁出現(xiàn)斷裂,結(jié)構(gòu)扭曲不完整,大部分不能連接成網(wǎng)狀;與OVX組相比,OVX+MVHP組骨小梁有所恢復(fù),骨小梁間隙變小,排列尚整齊并相互連接。Sham組脛骨骨髓腔較小,骨小梁致密且相互連接;與Sham組相比,OVX組脛骨骨髓腔變大,骨小梁松散;與OVX組相比,OVX+MVHP組骨髓腔變小,骨小梁斷裂情況改善。

    3 結(jié)論與討論

    切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢所致的骨質(zhì)疏松,能夠正確模擬女性由于雌激素缺乏而引起骨質(zhì)疏松的臨床特征,是學(xué)術(shù)界目前公認(rèn)的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型,亦是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本文以去雙側(cè)卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型,以所研制的金針菇源VD2復(fù)合片劑為材料,比較了不同處理組大鼠血清鈣、磷、AKP、StrACP等生化指標(biāo)及臟器指數(shù)、子宮和骨組織形態(tài)病理學(xué)等指標(biāo)變化,結(jié)果表明,與Sham組比較,OVX組大鼠子宮系數(shù)、組織病理學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)及骨組織病理學(xué)均有顯著差異,說(shuō)明去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。與OVX組相比,OVX+MVHP組血清鈣濃度顯著升高(p<0.05),AKP濃度顯著降低(p<0.05),而血清磷和StrACP濃度無(wú)顯著差異(p>0.05),心、肝、腎、子宮等臟器指數(shù)差異顯著(p<0.05),而脾臟無(wú)顯著差異(p>0.05);子宮管徑厚度和子宮黏膜上皮厚度顯著升高(p<0.05),子宮腔徑厚度顯著降低(p<0.05),股骨和脛骨骨小梁致密,小梁間距和骨髓腔變小。初步表明金針菇源VD2復(fù)合片劑對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防和治療作用,研究結(jié)果為紫外照射提高VD2含量的食用菌的生物利用度,以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)和重要參考。

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