不同酶對羊血紅蛋白酶解液抗氧化活性的影響

王珍如，訾 陽，杜賀陽，馮 波，高 峰，格日勒圖

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

中國是全世界最大的羊肉生產(chǎn)國與消費國，2018年我國羊肉產(chǎn)量為475 萬t[1]。羊血一般占畜禽活體重的4.0%～9.8%[2]，在我國每年可得動物血液230 萬t 以上，這是一個巨大的動物蛋白資源庫[3]。羊血中含有大量蛋白質(zhì)、維生素、血紅素、微量元素等多種活性物質(zhì)，具有一定的保健功能[4]。盡管羊血來源豐富，但其在我國的利用率較低，有相當(dāng)大一部分未經(jīng)合理利用直接排放，造成環(huán)境污染和羊血資源的浪費[5]。

生物活性肽是一種相對分子質(zhì)量介于50～10 000 Da，對機體有益或具有一定生物活性的肽類化合物[6]，具有吸收快、效率高等優(yōu)點，在食品加工、飼料生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7]。其制備方法多種多樣，其中酶解法成本低，生產(chǎn)條件溫和，成為活性肽制備的常用方法之一[8]動物血液可以加工為生物活性肽而被高效利用，但將羊血開發(fā)成生物活性肽的報道較少。因此，本試驗以羊血紅蛋白為原料，開展羊血紅蛋白酶解液體外抗氧化活性的研究，為羊血資源的深加工利用提供的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 羊血采自內(nèi)蒙古省四子王旗屠宰場，過濾除雜后-20℃避光保存?zhèn)溆茫褂们爸糜?℃過夜解凍；原料超聲破膜處理，冷凍干燥制得羊血紅蛋白粉4℃保存?zhèn)溆?。凱氏定氮法測定其蛋白含量為90.53%。胃蛋白酶（4×105U/g）、木瓜蛋白酶（5×105U/g）、中性蛋白酶（5×105U/g）、胰蛋白酶（4×105U/g）均購于北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 羊血紅蛋白酶解液的制備方法 羊血3 500 r/min 離心10 min，棄上層血漿，收集下層血細胞加入等體積去離子水超聲破膜30 min，冷凍干燥成粉。將血紅蛋白粉與去離子水以1:5（m/v，g/mL）比例混合，試驗組分別添加3%（占血粉質(zhì)量）的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，對照組不加酶。參照表1 條件進行酶解5 h，每隔1 h 取一次樣，沸水浴滅酶10 min，3 500 r/min 離心20 min 棄去細胞碎片及其不溶物，上清液-20℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)的測定。

表1 蛋白酶的種類及酶解條件

1.3 蛋白質(zhì)含量的測定 參照王金燦[9]方法采用全自動凱式定氮儀進行蛋白質(zhì)含量的測定。

1.4 氨基酸態(tài)氮含量及水解度的測定 采用甲醛電位滴定法測定氨基酸態(tài)氮含量[10]。水解度（Degree of Hydrolysis，DH）計算公式：

DH=（酶解液中氨基酸態(tài)氮含量/樣品中總氮量）×100%

1.5 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的測定 參照文飛[11]方法并稍做改動，配制0.1 mol/L DPPH 無水乙醇溶液，避光保存。取酶解液0.5 mL 加入0.5 mL DPPH 溶液于1.5 mL 離心管中混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm 處測定吸光度。試驗設(shè)置空白組（超純水代替樣品）、對照組（無水乙醇代替DPPH 溶液）及試驗組，每組設(shè)置3 個平行；DPPH 自由基清除率計算公式：

DPPH 自由基清除率=1－（Ai－Aj）/Ac×100%式中，Ai 為樣品組吸光度，Aj 為對照組吸光度，Ac 為空白組吸光度。

1.6 羥自由基（.OH）清除能力的測定 采用水楊酸法[12]略做修改，取0.5 mL 酶解液、1 mL 2.3 mol/L 硫酸亞鐵溶液、1 mL 2.3 mol/L 水楊酸-乙醇溶液、1 mL 2.2 mol/L 過氧化氫溶液于具塞試管中，混勻靜置30 min，以超純水為參比，于波長510 nm 處測定吸光度值（Ai）；試驗設(shè)置空白組（超純水代替樣品）、對照組（蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液）及試驗組，所有試驗均重復(fù)測定3次；.OH 清除率計算公式：

式中，Ai 為樣品組吸光度，Aj 為對照組吸光度，Ac 為空白組吸光度。

1.7 2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力的測定 參考文飛[11]方法略微修改，ABTS 工作液的配制：取0.007 4 mol/L 的ABTS 溶液0.2 mL 與0.002 6 mol/L 的過硫酸鉀溶液0.2 mL 混勻，室溫避光反應(yīng)13 h 形成ABTS+工作液。使用前，先用pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液將工作液稀釋40～50 倍，然后在波長734 nm 處測定其吸光度值在（0.20±0.02）。取酶解液0.2 mL 加0.8 mL ABTS+工作液，振蕩搖勻10 s，室溫靜置6 min，于波長734 nm 處測定吸光度（A）。試驗設(shè)置空白組（95%乙醇代替樣品）；所有試驗均重復(fù)測定3 次；ABTS+清除率計算公式：

式中，A 為樣品組吸光度，A0 為空白組吸光度。

1.8 還原力的測定 參考張鳳英[10]的操作方法略作修改，取酶解液0.5 mL 于試管中，加入1%wt 鐵氰化鉀溶液1 mL，pH=6.60 磷酸鹽緩沖液1 mL，50℃水浴30 min，再加入10%wt 三氯乙酸1 mL，混勻離心（3 000 r/min，10 min），取上清液1 mL，加入1 mL 去離子水和0.1%wt三氯化鐵溶液0.25 mL，混勻于50℃溫育10 min，等體系顏色由淡黃色變?yōu)樗{色時混勻，以超純水為空白對照，于波長700 nm 處測定吸光度值；所有試驗平行測定3 次，吸光度值越大，表示還原力越強。

1.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 和SAS 9.0 一般線性模型統(tǒng)計分析，Duncan′s 法進行多重比較；結(jié)果以均值±標(biāo)準誤差表示，用Origin 2017 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶處理對羊血紅蛋白水解度的影響 如圖1 所示，各蛋白酶對羊血紅蛋白均有一定的水解能力，木瓜蛋白酶組水解度極顯著高于其他組。隨著酶解時間的延長，各組酶解液水解度均表現(xiàn)出木瓜蛋白酶組＞胃蛋白酶組＞中性蛋白酶組＞胰蛋白酶組＞空白對照組（P＜0.05）；酶解過程中，木瓜蛋白酶組、胃蛋白酶組和胰蛋白酶組水解度均呈上升趨勢；中性蛋白酶組水解度于4 h 前極顯著升高4 h 后則呈降低趨勢；5 h 時木瓜蛋白酶組、胃蛋白酶組及胰蛋白酶組水解度均達到最大，分別為39.27%、31.03% 和10.72%，其中木瓜蛋白酶組極顯著高于其他兩組；空白對照組水解度維持在1%左右。

圖1 不同酶對羊血紅蛋白水解度的影響

2.2 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液DPPH 自由基清除能力的影響 如圖2 所示，不同蛋白酶組酶解液均表現(xiàn)出不同的DPPH 自由基清除能力，胃蛋白酶組DPPH自由基清除能力極顯著高于其他組。隨著酶解時間的延長，胃蛋白酶組及中性蛋白酶組DPPH 自由基清除力均呈先增加后減少的趨勢，木瓜蛋白酶組和胰蛋白酶組則呈上升趨勢；3 h 前DPPH 自由基清除力呈胃蛋白酶組＞中性蛋白酶組＞木瓜蛋白酶組＞空白對照組＞胰蛋白酶組，3 h 后則表現(xiàn)為胃蛋白酶組＞木瓜蛋白酶組＞中性蛋白酶組＞空白對照組＞胰蛋白酶組（P＜0.01）；4 h時胃蛋白酶組清除力最大為98.06%，極顯著高于其他組；2 h 時中性蛋白酶組清除力達到峰值94.62%，顯著高于其他時間段，僅次于胃蛋白酶組；酶解至5 h 時，木瓜蛋白酶組、胰蛋白酶組及空白對照組DPPH 自由基清除能力達到最大分別為94.62%、32.06% 和54.57%（P＜0.05）；空白對照組DPPH 自由基的能力始終維持在50%左右。由此可見，4 種酶解產(chǎn)物均有清除DPPH自由基的能力，從清除DPPH 自由基角度評價胃蛋白酶是酶解羊血紅蛋白產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

圖2 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液DPPH 自由基清除能力的影響

2.3 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液對.OH 清除能力的影響 由圖3 可知，各蛋白酶組均表現(xiàn)出一定的.OH 清除力，中性蛋白酶組.OH 清除力極顯著高于其他組。各組酶在各時間段.OH 清除力均呈中性蛋白組＞胰蛋白酶組＞空白對照組＞木瓜蛋白酶組＞胃蛋白酶組（P＜0.05）；隨著酶解時間的延長，中性蛋白酶組、胰蛋白酶組和胃蛋白酶組酶解液.OH 清除力均先升高后降低；而木瓜蛋白酶組呈先上升后下降最后上升的趨勢；胰蛋白酶組于2 h 時清除力達到最大值90.48%且組內(nèi)差異極顯著；3 h時中性蛋白酶組、木瓜蛋白酶組和胃蛋白酶組.OH 清除力均達到峰值，分別為95.89%、55.64% 和46.48%（P＜0.05）；空白對照組.OH 清除力較為穩(wěn)定，維持在66%左右；從.OH 清除力角度評價，中性蛋白酶是酶解羊血紅蛋白產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

圖3 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液羥自由基清除能力的影響

2.4 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液清除ABTS 自由基能力的影響 由圖4 可知，隨著時間的延長，各組蛋白酶酶解液均表現(xiàn)出一定的ABTS 自由基清除能力。2 h時中性蛋白酶組清除ABTS 自由基能力極顯著高于其他組；除2 h 外，木瓜蛋白酶組清除ABTS 自由基除能力均極顯著高于其他組。隨著時間的延長，木瓜蛋白酶組與中性蛋白酶組均先上升后下降再略升高；胰蛋白酶組清除ABTS 自由基能力呈逐步下降的趨勢；胃蛋白酶組則先上升后趨于平穩(wěn)；2 h 時中性蛋白酶清除ABTS 自由基能力最大為77.21%，木瓜蛋白酶組為77.11%，兩組組間差異不顯著；4 h 時胃蛋白酶組清除ABTS 自由基能力達到峰值64.86%，組內(nèi)差異顯著；空白對照組清除ABTS 自由基能力維持在72%左右。

圖4 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液清除ABTS 自由基能力的影響

2.5 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液還原力的影響 由圖5 可知，隨著時間的延長，各組蛋白酶酶解液均表現(xiàn)出較強的還原力，胃蛋白酶組還原力極顯著高于其他組。酶解過程中，還原力于各時間段均呈胃蛋白酶組＞木瓜蛋白酶組＞中性蛋白酶組＞胰蛋白酶組＞空白對照組（P＜0.05）；隨著酶解時間的增長，木瓜蛋白酶組和中性蛋白酶組還原力先升高后降低，4 h 時2 組還原力均達到峰值0.61，2 組組內(nèi)差異極顯著；胃蛋白酶組還原力先升高后降低，2 h 時還原力最大為0.96，組內(nèi)差異顯著；胰蛋白酶組逐步升高，5 h 還原力達到峰值0.51，組內(nèi)差異顯著；空白對照組還原力較平穩(wěn)始終維持在0.3左右。從還原力角度評價，胃蛋白酶是酶解羊血紅蛋白酶產(chǎn)生高抗氧化活性物質(zhì)的最佳用酶。

圖5 不同酶處理對羊血紅蛋白酶解液還原力的影響

3 討 論

畜禽血液作為資源豐富的工業(yè)副產(chǎn)品，營養(yǎng)價值較高，利用其制備抗氧化肽逐步成為新的應(yīng)用趨勢[14]。目前，酶解法是制備多肽最常用的方法，可根據(jù)不同的蛋白酶對同一蛋白源酶切位點的特異性，使其產(chǎn)生功能不同的多肽片段[15]；由于不同類型的蛋白酶的水解能力和作用位點不同，因此水解度及酶解產(chǎn)物的特性也有較大的差異[16]。本試驗中各蛋白酶對羊血紅蛋白均有不同程度的水解能力，其中木瓜蛋白酶組水解度最高達39.27%，極顯著高于其他組。此結(jié)果表明木瓜蛋白酶水解羊血紅蛋白能力較強；木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)中精氨酸和賴氨酸的羧基端，可優(yōu)先水解在肽鍵的N-端具有二個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵[17]，打破了羊血紅蛋白天然的蛋白結(jié)構(gòu)，形成了開放、暴露的氨基酸殘基，增加了酶解液中疏水性氨基酸含量[13]。

抗氧化劑通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化或螯合過渡金屬離子達到抗氧化目的[11]，抗氧化能力并非某單一試驗結(jié)果可說明，需要各指標(biāo)綜合考慮[18]。DPPH自由基是很穩(wěn)定的、以氮為中心的自由基，常用于體外清除自由基活性評價[19]。本試驗中各組蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH 自由基均有一定的清除能力，其中胃蛋白酶組酶解液清除DPPH 自由基效率極顯著高于其他組；3 h 前中性蛋白酶組酶解液DPPH 清除率較木瓜蛋白酶組高，僅次于胃蛋白酶組，3 h 后木瓜蛋白酶組酶解液清除率較高。此結(jié)果說明，胃蛋白組酶解液具有較強的提供質(zhì)子的能力，而中性蛋白酶與木瓜蛋白酶組提供質(zhì)子的能力僅次于胃蛋白酶組，質(zhì)子與自由基結(jié)合后就可以阻止自由基對機體細胞的氧化損傷。Sarapultsev 等[20]研究表明，水解度與羊血紅蛋白酶解液抗氧化能力也有一定關(guān)系，但并不是水解度越高抗氧化性越好，這與本研究結(jié)果一致；水解反應(yīng)的終產(chǎn)物為氨基酸，較高的水解度使羊血紅蛋白酶解過程中產(chǎn)生的抗氧化能力較強的短肽切斷，降低了酶解液的抗氧化活性。

在正常情況下，機體代謝產(chǎn)生的微量活性氧（ROS）對維持細胞正常功能有一定積極作用，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，機體會產(chǎn)生過量ROS，誘導(dǎo)細胞損傷、凋亡和壞死[21]；.OH 是一種氧化能力很強的活性氧自由基，對機體有很大的損傷性[22]。本試驗中各蛋白酶酶解液均具有清除.OH 自由基的能力，其中中性蛋白組酶解液對.OH自由基清除效果極顯著高于其他組，最佳酶解時間為3 h，與吳國宏等[13]的部分研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，中性蛋白酶除將羊血紅蛋白進行水解外，還增強了酶解液中具有抗氧化活性的物質(zhì)，導(dǎo)致.OH 自由基的清除率升高；中性蛋白酶作為肽鏈內(nèi)切酶，水解羊血紅蛋白形成氨基酸殘基[23]使酶解液中能清除.OH 自由基的可溶性抗氧化多肽增加，提升了酶解液的抗氧化能力[21]。

ABTS 法是一種用于體外測定物質(zhì)抗氧化能力的方法，不易受到提取物的光譜干擾，具有操作簡單、快速、準確性好、精密度高等優(yōu)點[24]。本試驗中各組羊血紅蛋白酶解液均具有清除ABTS 自由基的能力，其中2 h時中性蛋白酶組清除力最大，木瓜蛋白酶的清除力除2 h外均極顯著高于其他組，表明各組蛋白酶酶解液中產(chǎn)生了可以高效清除ABTS 自由基的物質(zhì)。ABTS 與過二硫酸鉀反應(yīng)后生成綠色的ABTS 自由基在734 nm 有最大吸收峰[25]，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基氧化速率較高，而2 h 時中性蛋白酶酶解產(chǎn)物對ABTS 自由基氧化速率高于木瓜蛋白酶組，證明2 h 時中性蛋白酶酶解羊血紅蛋白可產(chǎn)生較多能與ABTS 自由基反應(yīng)的小肽，導(dǎo)致734 nm 時吸光度降低，證明其抗氧化活性較強。

屈義等[22]研究證明，物質(zhì)自身的抗氧化能力與還原力有關(guān)，可通過測定其總還原力來表示抗氧化程度的強弱。本試驗中各組羊血紅蛋白酶解液均有一定的還原力，其中胃蛋白酶組酶解液還原力最強，結(jié)果表明胃蛋白酶可酶解羊血紅蛋白產(chǎn)生還原力較強的產(chǎn)物，進一步影響其抗氧化活性；胃蛋白酶水解的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵，可增加羊血紅蛋白酶解液中還原性基團的多肽及疏水性氨基酸含量[13]。羊血紅蛋白酶解物的還原能力與酶解后暴露出的氨基酸殘基有關(guān)，它們可能含有側(cè)鏈-OH 或能提供電子[14]。一般情況下，還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)，還原力越強，抗氧化能力越強[18]，因此胃蛋白酶與其他組酶相比，有較強的還原力。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，酶解羊血紅蛋白可獲得具有抗氧化活性的產(chǎn)物，其中中性蛋白酶組羥自由基清除力及2 h對ABTS 自由基的清除力均極顯著高于其他組；木瓜蛋白酶組水解度及除2 h 外對ABTS 自由基的清除力均極顯著高于其他組；胃蛋白酶組DPPH 自由基清除力及還原力極顯著高于其他組。綜合清除自由基能力與還原力角度考慮，用中性蛋白酶酶解的羊血紅蛋白酶解液具有較好抗氧化活性，可作為開發(fā)羊血抗氧化肽的工具酶。