錫林郭勒牧區(qū)酸馬奶天然發(fā)酵劑中風(fēng)味物質(zhì)及微生物多樣性

于佳琦，夏亞男，喬曉宏，靳志敏，李鵬亮，王 茹，王 洋，雙 全,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.阿巴嘎旗照富經(jīng)貿(mào)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古錫林郭勒 011400；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；4.呼和浩特市食品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

錫林郭勒牧區(qū)是蒙古族文化的主要發(fā)源地之一，馬匹和酸馬奶是其民族文化的重要組成部分[1]。2019年錫林郭勒地區(qū)的馬匹數(shù)量超過15萬。母馬的產(chǎn)奶期約73 d，屬于季節(jié)性生產(chǎn)[2]，不同季節(jié)馬奶的售價(jià)在30～40元/公斤不等。傳統(tǒng)的酸馬奶是往馬奶中添加天然發(fā)酵劑后，在乳酸菌和酵母菌的作用下產(chǎn)酸產(chǎn)氣的輕度酒精飲料。高品質(zhì)的酸馬奶均勻不分層，具有發(fā)酵的香氣以及二氧化碳的刺激感[1]。發(fā)酵風(fēng)味和保存在很大程度上取決于天然發(fā)酵劑中的微生物群，因此，優(yōu)質(zhì)的天然發(fā)酵劑是維系酸馬奶產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。為了開發(fā)工業(yè)應(yīng)用的新產(chǎn)品并保護(hù)傳統(tǒng)酸馬奶中的微生物多樣性，對(duì)酸馬奶天然發(fā)酵劑的自有風(fēng)味、微生物組成及功能進(jìn)行詳細(xì)的研究是十分有意義的。

Illumina Miseq測(cè)序是一種高通量、高精度、省時(shí)省力的第二代測(cè)序技術(shù)[3-4]，這一技術(shù)可以檢測(cè)到很多非培養(yǎng)、低豐度的微生物[5-6]，并且彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的基于分離培養(yǎng)和生理生化鑒定建立系統(tǒng)發(fā)育樹的局限，已廣泛應(yīng)用于對(duì)發(fā)酵食品微生態(tài)的研究。近年來，較多研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)探究酸馬奶的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)以及不同的牧民制作的酸馬奶細(xì)菌群落大多由乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、醋酸桿菌屬、腸球菌以及部分低豐度細(xì)菌屬組成[7-8]。由于傳統(tǒng)的酸馬奶天然發(fā)酵劑都是將釀成的酸馬奶取出部分保留而得，因此發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌群落組成與發(fā)酵酸馬奶的組成相似[9]。而對(duì)酸馬奶及引子中真菌多樣性的探究比較少，本文是首次使用Illumina MiSeq第二代高通量測(cè)序技術(shù)專門調(diào)查酸馬奶天然發(fā)酵劑中完整的微生物群落多樣性并預(yù)測(cè)其中的功能信息。

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）及Illumina Miseq第二代測(cè)序技術(shù)分析錫林郭勒牧區(qū)酸馬奶天然發(fā)酵劑的主要風(fēng)味物質(zhì)及核心微生物群落結(jié)構(gòu)，全面揭示酸馬奶天然發(fā)酵劑的風(fēng)味組成與微生物多樣性，并結(jié)合功能預(yù)測(cè)分析風(fēng)味相關(guān)功能基因，以期為工業(yè)化生產(chǎn)酸馬奶的風(fēng)味調(diào)控、品質(zhì)優(yōu)化和安全保障提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸馬奶天然發(fā)酵劑樣本 于2019年6月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟阿巴嘎旗的3個(gè)平行樣品（命名為YZ_1，YZ_2，YZ_3），在測(cè)定總酸度和pH后分裝于采樣管，封口并于干冰中轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，冷凍保存用于后續(xù)試驗(yàn)；3-辛醇（純度≥98%） 上海麥克林生化科技有限公司；E.Z.N.A.?soil DNA kit美國Omega Bio-tek；瓊脂糖 西班牙biowest；FastPfu Polymerase 中國TransGen；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen。

FG2-ELK便攜式pH計(jì) Mettler Toledo；NEVAP-45氮吹儀 美國Organomation；Thermo Trace 1300-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo；DB-Wax（30 m×0.250 mm×0.25 μm）色譜柱 美國Agilent；日立CF16RN冷凍離心機(jī) 日本Hitachi；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI；5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國Eppendorf；Miseq PE300測(cè)序儀 美國Illumina。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸馬奶天然發(fā)酵劑pH及總酸度測(cè)定 在采樣現(xiàn)場(chǎng)通過便攜式pH計(jì)測(cè)定pH，滴定酸度參照GB 5009.237-2016《食品pH值的測(cè)定》中酚酞指示劑法測(cè)定。

1.2.2 風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定方法

1.2.2.1 樣品前處理 參照蘇海榮[10]的方法并稍作改進(jìn)，取天然發(fā)酵劑樣品10 g，加入200 μL質(zhì)量濃度為310 mg/L的3-辛醇內(nèi)標(biāo)物，加入氯化鈉至過飽和（有利于香氣物質(zhì)的萃?。?。取溶液于50 mL離心管中，4 ℃下分別用10和5 mL的乙醚以5500 r/min離心5 min萃取2次，合并上層有機(jī)相。氮吹濃縮至約0.2 mL，再以乙醚復(fù)融定容至2.0 mL，無水Na2SO4干燥，0.22 μm有機(jī)相膜過濾，供GC/MS上機(jī)分析。樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.2.2 GC-MS檢測(cè)條件 色譜條件：參照洪家麗等[11]方法并稍作改進(jìn)，進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣不分流，程序升溫為40 ℃保持5 min，以3 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。質(zhì)譜條件：離子化方式：EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～500 m/z 。

1.2.2.3 定性定量分析 利用Xcalibur工作站NIST譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析。采用半定量的方法計(jì)算各風(fēng)味化合物的相對(duì)含量，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（3-辛醇）與各組分峰面積比值計(jì)算[12]。

1.2.3 樣品總DNA提取 使用 E.Z.N.A.?soil DNA kit試劑盒進(jìn)行微生物群落總DNA抽提。提取成功后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，并使用NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測(cè)序 細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)：上游引物：338F（5’-ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物806R（5’-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。

真菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增：上游引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'），下游引物：ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃進(jìn)行保存。

PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下 游 引 物（5 μmol/L）0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合，之后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物[13]。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產(chǎn)物后用 Quantus? Fluorometer進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。寄于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，質(zhì)控過濾測(cè)序質(zhì)量低、錯(cuò)配率高和不能進(jìn)行拼接的序列，得到優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行分析處理。利用上海美吉公司提供的Sanger生物云信息平臺(tái)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析及微生物功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸馬奶天然發(fā)酵劑中風(fēng)味物質(zhì)分析

采用液液萃取與氣質(zhì)聯(lián)用法（LLE-GC/MS）測(cè)定鮮馬奶天然發(fā)酵劑中風(fēng)味化合物，總離子流圖見圖1。

由圖1可以看出，風(fēng)味化合物分離效果較好，物質(zhì)種類豐富。在天然發(fā)酵劑中共檢測(cè)到43種風(fēng)味物質(zhì)，包括18種酸類、15種酯類、6種醇類、3種芳香族化合物和1種酮，見表1。酸類物質(zhì)是主要風(fēng)味物質(zhì)，檢測(cè)到的種類及含量（891.69±2.69 μg/g）均最高，其中乙酸、L-乳酸、棕櫚酸、月桂酸、癸酸和肉豆蔻酸含量均高于80 μg/g，為酸馬奶天然發(fā)酵劑主要酸類物質(zhì)。酸類物質(zhì)的產(chǎn)生主要是通過乳酸菌發(fā)酵底物中的可發(fā)酵糖。酸馬奶天然發(fā)酵劑中L-乳酸是含量最高的酸類物質(zhì)，賦予酸馬奶乳的清香以及爽口的風(fēng)味[14]。乙酸具有醋酸味，口感刺激，酸而不澀。辛酸和癸酸能賦予乳制品更好的奶香品質(zhì)，其含量越高，對(duì)奶香味的貢獻(xiàn)越大[15]?？梢娝犷愇镔|(zhì)為天然發(fā)酵劑的刺激口感及奶香味做出了較大貢獻(xiàn)。

酸馬奶天然發(fā)酵劑中，酯類物質(zhì)種類和總含量（477.04±9.45 μg/g）僅次于酸類物質(zhì)。其中辛酸乙酯、9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯和E-11-十六碳烯酸乙酯含量高于40 μg/g，是主要的酯類物質(zhì)。大多數(shù)酯類物質(zhì)都具有水果和花香味，有研究發(fā)現(xiàn)酯類的形成高度依賴于酵母菌的存在，不同的酵母菌株可以提供形成不同的香氣，酯含量的變化也取決于其特定的真菌微生物群落[16]。

圖1 酸馬奶天然發(fā)酵劑風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of koumiss natural starter flavor substances

表1 酸馬奶天然發(fā)酵劑中風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Flavor substances in koumiss natural starter

醇類物質(zhì)是酸馬奶天然發(fā)酵劑中不可或缺的風(fēng)味物質(zhì)，但其風(fēng)味閾值較高，因此對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)度較小[17]。本試驗(yàn)中共檢測(cè)到6種醇類物質(zhì)，其中2,3-丁二醇、十二硫醇、異戊醇、苯乙醇和異丁醇5種醇類物質(zhì)含量較高。據(jù)報(bào)道，異戊醇具有水果香和雜醇味，苯乙醇具有典型的清甜的玫瑰花香[18]，可見不同的醇類物質(zhì)為酸馬奶復(fù)雜的風(fēng)味及口感做出了一定貢獻(xiàn)。此外還檢測(cè)到苯乙烯、1,3-二叔丁基苯、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚3種芳香族類和3-羥基-2-丁酮。3-羥基-2-丁酮又稱乙偶姻，是發(fā)酵乳產(chǎn)品中普遍存在的一種對(duì)風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的酮類物質(zhì)，它能夠賦予發(fā)酵乳奶香氣[19]，對(duì)酸乳奶香味的增加起到?jīng)Q定性作用。

傳統(tǒng)的酸馬奶天然發(fā)酵劑大多是發(fā)酵后的酸馬奶留存下來的一部分，乳酸菌和酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的各種酶通過一系列生化過程將原料乳分解為醇、醛、酯和氨基酸等，從而形成了獨(dú)特的風(fēng)味[20]，可見發(fā)酵乳的風(fēng)味品質(zhì)與其微生物群落密切相關(guān)，因此綜合分析酸馬奶天然發(fā)酵劑的風(fēng)味組成及微生物多樣性至關(guān)重要。

2.2 酸馬奶天然發(fā)酵劑中微生物多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌和真菌序列的豐度和多樣性 通過Illumina Miseq高通量測(cè)序從3個(gè)酸馬奶天然發(fā)酵劑樣本中共獲得180069條細(xì)菌和187397條真菌高質(zhì)量的優(yōu)化序列，樣本的平均讀數(shù)分別為60023（SD=7028）和62466（SD=8359）。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行劃分，按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，結(jié)果表明，所有樣本細(xì)菌序列歸屬于5個(gè)門，7個(gè)綱，17個(gè)目，22個(gè)科，33個(gè)屬，49個(gè)種，52個(gè)OTU。所有樣本真菌序列歸屬于4個(gè)門，11個(gè)綱，18個(gè)目，32個(gè)科，43個(gè)屬，59個(gè)種，98個(gè)OTU。

表2是關(guān)于樣本信息及Alpha多樣性指數(shù)表，Alpha多樣性是評(píng)價(jià)微生物群落豐富性和多樣性的指標(biāo)。Chao1和Ace指數(shù)用來估算測(cè)序樣本中所含OTU個(gè)數(shù)，反映群落豐富度[21]。本試驗(yàn)中樣本真菌的平均Chao1指數(shù)（83.99±23.62）和Ace指數(shù)（94.51±30.44）均明顯高于細(xì)菌的Chao1指數(shù)（49.89±8.56）和Ace指數(shù)（52.75±6.59）。Simpson和Shannon指數(shù)表征群落多樣性，當(dāng)Simpson指數(shù)值越小，Shannon值越大時(shí)，說明群落多樣性越高[22]。結(jié)果顯示細(xì)菌群落多樣性（Simpson指數(shù)0.52±0.06；Shannon指數(shù)1.20±0.12）高于真菌群落多樣性（Simpson指數(shù)0.84±0.05；Shannon指數(shù)0.50±0.13）。以上α多樣性指數(shù)表明該批次酸馬奶發(fā)酵劑雖然真菌物種豐富度高于細(xì)菌，但細(xì)菌的微生物群落多樣性更高。

將抽平后的細(xì)菌和真菌序列作稀釋性曲線，見圖2，稀釋性曲線趨于平緩，且隨著測(cè)序量的增大，實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)不斷減小，表明測(cè)序量的合理性，但真菌稀釋性曲線中第三組樣本的實(shí)際觀測(cè)到的物種低于其余兩組，說明該組樣本的重復(fù)性略差，可能與樣品本身以及測(cè)序環(huán)境有關(guān)。細(xì)菌和真菌的Shannon-Wiener曲線趨于平坦，測(cè)序趨于飽和，結(jié)合表中樣本的Coverage值均大于99.9%，表明該測(cè)序結(jié)果能充分解釋鮮馬奶發(fā)酵劑樣品的微生物群落信息，僅有很少一部分的微生物群落未被覆蓋到。

2.2.2 細(xì)菌群落組成多形性分析 將每個(gè)OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3，所有細(xì)菌序列歸屬于5個(gè)細(xì)菌門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和Patescibacteria。天然發(fā)酵劑的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為厚壁菌門，平均相對(duì)豐度87.78%，其次為變形菌門，平均相對(duì)豐度12.00%，兩個(gè)細(xì)菌門總計(jì)占整個(gè)酸馬奶引子樣本的99.78%，而其余未提及到的細(xì)菌門相對(duì)豐度較低，均在1%以下。在屬水平上共鑒定出了33個(gè)細(xì)菌屬。平均相對(duì)豐度大于1%的屬共有五個(gè)，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、勞特菌屬（Raoultella）和鏈球菌屬（Streptococcus），總計(jì)占細(xì)菌群落的97.41%。酸馬奶天然發(fā)酵劑的群落組成中，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度最高（72.26%），其次為乳球菌屬（11.92%），這與前人的研究結(jié)果一致[23]。

乳酸桿菌、乳球菌以及鏈球菌被定義為天然發(fā)酵乳中的核心微生物群，它們的代謝終產(chǎn)物和酶對(duì)發(fā)酵乳的質(zhì)地風(fēng)味有重要的影響[24]，并可以通過產(chǎn)生有機(jī)酸和抗生素等物質(zhì)抑制腐敗菌和病原微生物的生長[25]。趙飛燕等[26]研究發(fā)現(xiàn)鮮馬奶中存在腸球菌屬、腸桿菌屬以及芽孢桿菌和氣單胞菌等有害微生物，可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)地，顏色和風(fēng)味變差，也可能對(duì)消費(fèi)者的健康狀況有所影響，產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病。本實(shí)驗(yàn)在采樣時(shí)測(cè)得酸馬奶天然發(fā)酵劑pH為3.69±0.03，滴定酸度為169.90±17.36 °T。天然發(fā)酵劑的低pH環(huán)境、乳酸菌的競(jìng)爭性保護(hù)作用和特有微生物產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)等可以抑制有害微生物生長，提升產(chǎn)品的品質(zhì)。

傳統(tǒng)乳制品酸馬奶在世界各地已有長時(shí)間的消費(fèi)歷史，經(jīng)過長期的自然選擇作用，優(yōu)質(zhì)的乳酸菌菌種已經(jīng)流傳下來[27]。生產(chǎn)酸馬奶所添加的天然發(fā)酵劑，更是獲得優(yōu)質(zhì)乳酸菌的良好來源。

表2 樣本細(xì)菌和真菌信息及Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Sample bacterial and fungal information and Alpha diversity index

圖2 樣本的稀釋性曲線和Shannon-Wiener曲線Fig.2 Sample dilution curve and Shannon-Wiener curve

圖3 酸馬奶天然發(fā)酵劑基于門水平（a）和屬水平（b）細(xì)菌相對(duì)豐度柱狀圖Fig.3 Histogram of relative abundance of bacteria in koumiss natural starter based on phylum level (a) and genus level (b)

2.2.3 真菌群落組成多樣性分析 真菌也是酸馬奶天然發(fā)酵劑中非常重要的一類微生物區(qū)系。通過ITS序列，結(jié)果見圖4，絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)真菌被鑒定為子囊菌門（Ascomycota），相對(duì)豐度為99.32%。3個(gè)樣本共鑒定出43個(gè)真菌屬，數(shù)量明顯高于細(xì)菌屬，然而樣本平均相對(duì)豐度大于1 %的屬有2個(gè)，包括德克酵母屬（Dekkera）和克魯維酵母屬（Kluyveromyces），表明酸馬奶天然發(fā)酵劑中有很多低豐度存在的真菌微生物。德克酵母屬為優(yōu)勢(shì)真菌屬，相對(duì)豐度占94.09%。

酵母菌對(duì)酸馬奶的風(fēng)味、質(zhì)地和營養(yǎng)價(jià)值有著重要的促進(jìn)作用。酵母菌產(chǎn)生的酶分解形成脂肪酸，并進(jìn)一步發(fā)生酯化反應(yīng)得到具有芳香味的酯類[28]，可以與乳酸菌共同分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量的氨基酸[29]等。據(jù)調(diào)查，克魯維酵母、哈薩克斯坦酵母、假絲酵母屬等是酸馬奶中經(jīng)常被分離得到的酵母菌[30-32]。本試驗(yàn)中天然發(fā)酵劑的優(yōu)勢(shì)酵母菌種類與其他學(xué)者研究存在一定差異，分析原因可能與特定地區(qū)的氣候、草場(chǎng)等環(huán)境因素，和不同牧民傳統(tǒng)的制作方法以及所接種的發(fā)酵劑差異有關(guān)。而實(shí)際上，德克酵母屬在酸馬奶的真菌組成中也較常見，一些學(xué)者在新疆、青海、內(nèi)蒙古、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦等地的酸馬奶中分離得到了德克酵母屬[33-35]，只是沒有作為優(yōu)勢(shì)酵母菌被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)德克酵母可以產(chǎn)生醋酸氣味[36]，釀酒酵母、德克酵母與克魯維酵母等在乳制品發(fā)酵過程中對(duì)水解蛋白質(zhì)和脂肪、乳酸代謝、產(chǎn)生酒精和特殊風(fēng)味有突出貢獻(xiàn)[37-38]。如此看來，天然發(fā)酵劑中德克酵母和克魯維酵母的存在可以為發(fā)酵酸馬奶形成典型風(fēng)味起到積極促進(jìn)作用。

圖4 酸馬奶天然發(fā)酵劑基于門水平（a）和屬水平（b）真菌相對(duì)豐度柱狀圖Fig.4 Histogram of relative abundance of fungal in koumiss natural starter based on phylum level (a) and genus level (b)

2.3 功能預(yù)測(cè)分析

采用PICRUSt軟件對(duì)天然發(fā)酵劑中的細(xì)菌群落微生物進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。結(jié)果見表3，通過與KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）對(duì)比，共注釋到6類一級(jí)代謝通路，代謝作用（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）和環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）是主要代謝通路，平均占比分別為67.97%、14.04%和8.36%。在二級(jí)代謝通路中共注釋到42個(gè)子功能組成，其中屬于上述3類一級(jí)通路且相對(duì)豐度＞0.1%的子功能見表3。參與新陳代謝的菌群主要富集在碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism，16.24 %）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism，8.20%）等。遺傳代謝類通路中主要富集在翻譯（Translation，5.94%）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and repair，5.44%）以及折疊分類和降解（Folding, sorting and degradation，2.30%）。環(huán)境信息處理類通路中膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Membrane transport）和信號(hào)傳導(dǎo)（Signal transduction）為主要的子功能。在酸馬奶天然發(fā)酵劑中，碳水化合物代謝及氨基酸代謝作用最為突出。具體地，碳水化合物代謝主要包括三羧酸循環(huán)、糖酵解和磷酸戊糖途徑等，可產(chǎn)生大量的乙酸、檸檬酸等風(fēng)味中間代謝產(chǎn)物[39]。氨基酸可以在酶的作用下產(chǎn)生風(fēng)味成分[40]，由此推測(cè)天然發(fā)酵劑中的主要風(fēng)味物質(zhì)來源于碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑。除此之外還有很多的有益功能信息，如核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、聚糖生物合成和代謝（Glycan biosynthesis and metabolism）、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝（Metabolism of terpenoids and polyketides）等。

表3 KEGG數(shù)據(jù)庫主要代謝通路豐度值Table 3 Abundance of main metabolic pathways in KEGG database

經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在酸馬奶天然發(fā)酵劑細(xì)菌群落中預(yù)測(cè)到1623種酶，真菌群落中預(yù)測(cè)到847種，細(xì)菌群落和真菌群落中共有568種酶相同，表4是細(xì)菌真菌中豐度平均值排前50的酶類。從表4中可以看出，除與細(xì)菌、真菌生長相關(guān)的酶外，與代謝相關(guān)的酶中參與碳水化合物代謝和氨基酸代謝的酶廣泛存在。三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase）、蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase）、丙酮酸脫羧酶（Pyruvate decarboxylase）等均有發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖苷酶（Betagalactosidase）和α-半乳糖苷酶（Alpha-galactosidase）屬于乳桿菌目的酶，可催化生成低聚半乳糖及半乳糖寡糖，有益于人體的健康[40]。同時(shí)，乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase）、醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase）、蛋白酪氨酸磷酸酯酶（Protein-tyrosinephosphatase）、組氨酸激酶（Histidine kinase）等氨基酸代謝相關(guān)酶均存在，表明酸馬奶發(fā)酵劑中風(fēng)味物質(zhì)的很可能主要來源于糖代謝及氨基酸代謝，而乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase）、甘油激酶（Glycerol kinase）、醋酸激酶（Acetate kinase）等脂肪酶的存在說明還有一部分風(fēng)味物質(zhì)可能源自脂類代謝。

3 結(jié)論

本研究對(duì)錫林郭勒牧區(qū)酸馬奶天然發(fā)酵劑中的風(fēng)味物質(zhì)和微生物多樣性進(jìn)行了測(cè)定和分析。天然發(fā)酵劑中共檢測(cè)到43種風(fēng)味物質(zhì)，其中L-乳酸、棕櫚酸、月桂酸、乙酸、癸酸和肉豆蔻酸是主要酸類物質(zhì)，辛酸乙酯、9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯和E-11-十六碳烯酸乙酯是主要的酯類物質(zhì)，2,3-丁二醇、十二硫醇、異戊醇、苯乙醇和異丁醇5種醇相對(duì)含量較高，還有少量芳香族類和酮類化合物。微生物多樣性分析表明，細(xì)菌群落主要包括乳桿菌屬、醋酸菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬等，其中乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，相對(duì)豐度為72.26%。真菌群落主要包括德克酵母屬和克魯維酵母屬，其中德克酵母為優(yōu)勢(shì)真菌屬，相對(duì)豐度94.09%。酸馬奶天然發(fā)酵劑中真菌的豐富度更高，然而細(xì)菌微生物更多樣，表明多數(shù)的真菌微生物以低豐度存在。經(jīng)基因功能預(yù)測(cè)，發(fā)酵劑碳水化合物代謝及氨基酸代謝功能突出，且存在大量代謝通路中的酶基因，為酸馬奶發(fā)酵過程風(fēng)味物質(zhì)的形成奠定了遺傳基礎(chǔ)。