外泌體介導(dǎo)miR-106a靶向Smad7調(diào)控間皮細(xì)胞MMT對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的影響

朱 萌，張 寧，陶 偉

腹膜轉(zhuǎn)移是進(jìn)展期胃癌最常見的轉(zhuǎn)移方式。關(guān)于腹膜轉(zhuǎn)移，目前推測胃癌細(xì)胞、腹膜屏障之間的溝通與“對話”是形成移植瘤的關(guān)鍵，而在此之間起著傳遞“對話”作用的外泌體可能具有非常重要的作用。外泌體是一種細(xì)胞外物質(zhì)，由腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體稱為腫瘤源性外泌體(tumor-derived exosomes, TDEs)，在其生成和釋放過程中可以攜帶原發(fā)腫瘤重要信息物質(zhì)miRNA，隨外泌體以旁分泌的方式擴(kuò)散到周圍細(xì)胞或環(huán)境中，或經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)運輸至遠(yuǎn)隔器官，目的性地調(diào)整受體細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與并促進(jìn)癌組織的侵襲、轉(zhuǎn)移[1-2]。然而，外泌體是否參與胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移，外泌體在其中發(fā)揮的作用及機(jī)制，尚未有統(tǒng)一認(rèn)識。腹膜是癌細(xì)胞種植的場所，但癌細(xì)胞如何改造或調(diào)整以使其適宜于自身的種植尚有待于闡明。隨著外泌體研究不斷深入，證實胃癌細(xì)胞分泌的TDEs高表達(dá)miR-106a，TDEs搭載miR-106a進(jìn)入腹腔，在miR-106a與靶標(biāo)的作用下引發(fā)腹膜屏障損壞，腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)與功能發(fā)生改變，有可能參與腹膜轉(zhuǎn)移的過程[3]。本實驗基于以上理論，擬在分子水平探討TDEs-miR-106a-Smad7參與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料、設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)：RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，青鏈霉素，胰蛋白酶(Genview公司)。轉(zhuǎn)染：Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)，hsa-miR-106a mimic(Genepharma公司)。試劑盒：外泌體提取試劑盒(Invitrogen公司)，EdU檢測試劑盒(Ribobio公司)。其它試劑：Transwell小室(Costor公司)，GW788388 Hydrate(Sigma公司)，Recombinant Human TGF-β Protein(Sigma公司)。Western blot抗體：Smad7兔多克隆抗體(Proteinteck公司)，SMA兔多克隆抗體(SAB公司)，F(xiàn)ibronectin兔多克隆抗體(Abcam公司)，E-cadherin、N-cadherin兔多克隆抗體(Immunoway公司)。

1.2 外泌體提取培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移能力人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，無血清培養(yǎng)基處理2天后，吸取細(xì)胞上清液置于離心管內(nèi)，2 000 r/min離心20 min，采用微孔濾膜過濾，按1 ∶2比例加入外泌體提取試劑至細(xì)胞上清液中，顛倒混勻；4 ℃過夜；次日4 ℃ 10 000g離心1 h，棄上清，PBS重懸，獲得PBS-Exos。

1.3 細(xì)胞造模實驗分組：(1)HMrSV5、HMrSV5+Exos-control、HMrSV5+Exos-NC、HMrSV5+Exos-mimic；(2)HMrSV5、HMrSV5+Exos-TGF-β、HMrSV5+Exos-GW788388；(3)HMrSV5+TGF-β+Exos+OE-NC、HMrSV5+TGF-β+Exos+OE-Smad7。將獲得的PBS-Exos(8 μg)與HMrSV5細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，分別加入miRNA mimic轉(zhuǎn)染試劑、10 ng/mL TGF-β、10 μmol/L TGF-β抑制劑GW788388、過表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Smad7。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取生長至80%的細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶消化液，制備單細(xì)胞懸液；按每毫升5×105個接種6孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)過夜；次日制備轉(zhuǎn)染溶液：250 μL MEM中加入5 μL miRNA，柔和混勻；250 μL MEM中加入5 μL Lipofectamine 2000，柔和混勻；放置5 min后將兩者混合，再放置20 min，形成RNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物；加入細(xì)胞板中，繼續(xù)孵育4 h，更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 EdU檢測細(xì)胞增殖能力取上述處理后的細(xì)胞，消化離心后置于96孔板，每孔加入100 μL濃度為50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h，PBS洗滌2次，每次5 min；加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min；按順序加入2 mg/mL甘氨酸溶液50 μL，0.5%TritonX-100滲透液100 μL，1×Apollo染色液100 μL，0.5%TritonX-100滲透液100 μL，甲醇溶液100 μL，PBS洗滌；加入1×Hoechst 33342反應(yīng)液100 μL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，Leica DMI6000B倒置顯微鏡觀察拍照。每組3個復(fù)孔。

1.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá)取6孔板中常規(guī)培養(yǎng)的HMrSV5細(xì)胞，PBS洗滌后加入PMSF裂解液(稀釋比1 ∶100)，將細(xì)胞裂解液吸入EP管，4 ℃ 14 000 r/min離心10 min。取蛋白行BCA法定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量為20 μg，電泳耗時1.5 h。然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，電流300 mA。取出TBS漂洗，5%脫脂奶粉-TBS封閉，4 ℃搖床過夜。次日取出TBS洗膜，加一抗Smad7(稀釋比1 ∶1 000)、SMA(稀釋比1 ∶2 000)、Fibronectin(稀釋比1 ∶1 000)、E-cadherin(稀釋比1 ∶1 000)、N-cadherin(稀釋比1 ∶1 000)、GAPDH(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌，加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG，TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠圖像分析。

1.7 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移HMrSV5細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，按每毫升2×105個細(xì)胞100 μL加入24孔培養(yǎng)板中的Transwell小室，下室加入700 μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h；取出刮取小室上層細(xì)胞，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定20 min，置入結(jié)晶紫染色液中5 min，流水沖洗，封固，OLYMPUS CX41正置顯微鏡取6個互不重疊視野，用IPP軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞分泌外泌體傳遞miR-106a對間皮細(xì)胞增殖的影響采用胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS來源的外泌體，作用于腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5，觀察間皮細(xì)胞在外泌體miR-106a作用下的表型改變。EdU檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，Exos-control與Exos-mimic組陽性著色細(xì)胞數(shù)減少(圖1)，且以后者為甚，初步表明腹膜間皮細(xì)胞在AGS-Exos的作用下增殖活力減弱，外泌體傳遞miR-106a具有抑制腹膜間皮增殖的能力。

ControlExos-controlExos-mimic

2.2 外泌體介導(dǎo)miR-106a-Smad7對間皮細(xì)胞間質(zhì)性轉(zhuǎn)化(mesothelial-to-mesenchymal transition, MMT)的影響前期已經(jīng)證實miR-106a直接靶基因Smad7，為進(jìn)一步分析外泌體作用下間皮細(xì)胞的基因表達(dá)，采用Western blot法檢測Smad7及相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，HMrSV5細(xì)胞在給予外泌體處理后，Smad7、E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin表達(dá)升高(圖2)，四組間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(FSmad7=228.420，F(xiàn)E-cadherin=118.699，F(xiàn)N-cadherin=461.912，P均<0.000 1)。提示miR-106a-Smad7在外泌體作用下可能影響間皮細(xì)胞MMT。

圖2 Western blot法檢測Smad7、E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)：

2.3 TGF-β干預(yù)對間皮細(xì)胞增殖、MMT的影響TGF-β是細(xì)胞MMT轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵信號分子。給予TGF-β抑制劑GW788388后，EdU檢測HMrSV5細(xì)胞增殖活力的變化，結(jié)果顯示，與Control組相比，給予Exos-TGF-β處理后，HMrSV5細(xì)胞增殖活力下降，但給予Exos-GW788388后，細(xì)胞增殖活力有所恢復(fù)(圖3)，說明TGF-β誘導(dǎo)的信號可能參與間皮細(xì)胞表型的改變。Western blot法檢測顯示，Exos-TGF-β處理后，SMA、Fibronectin表達(dá)升高；但當(dāng)給予Exos-GW788388后，SMA、Fibronectin表達(dá)降低(圖4)，三組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(FSMA=61.449，F(xiàn)Fibronectin=665.186，P均<0.000 1)；提示間皮細(xì)胞表型和MMT的改變可能是TGF-β信號所誘導(dǎo)。

圖4 Western blot法檢測SMA、Fibronectin的表達(dá)：1.HMrSV5；2.HMrSV5+Exos-TGF-β；3.HMrSV5+Exos-TGF-β-GW788388

ControlExos-TGF-βExos-GW78838

2.4 Smad7過表達(dá)逆向觀察間皮細(xì)胞MMT及遷移能力AGS-Exos與pCMV-Smad7共同作用于HMrSV5細(xì)胞，再用TGF-β處理，逆向觀察靶基因的表達(dá)改變能否影響TGF-β/Smad7信號通路和間皮細(xì)胞表型。采用Western blot法檢測MMT相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，Smad7過表達(dá)組SMA、Fibronectin表達(dá)下降(圖5)，兩組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tSMA=7.772，P=0.001；tFibronectin=13.194，P<0.000 1)。Transwell實驗檢測顯示，給予Smad7過表達(dá)后，HMrSV5遷移能力下降，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組(圖6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.094，P<0.000 1)，表明Smad7的過表達(dá)可以抑制外泌體介導(dǎo)的間皮細(xì)胞MMT。

圖5 Western blot法檢測SMA、Fibronectin表達(dá)：1.HMrSV5+TGF-β+Exos+OE-NC；2.HMrSV5+TGF-β+Exos+OE-Smad7

圖6 Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力

3 討論

外泌體是由細(xì)胞所分泌的小的細(xì)胞器，富含選定的蛋白、脂類、核酸和糖復(fù)合物。在其生物發(fā)生過程中，通過質(zhì)膜內(nèi)陷和出芽釋放，具有重塑細(xì)胞外基質(zhì)、傳遞信號、調(diào)控生命活動等作用，在人體發(fā)育、免疫、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用[4]。研究顯示，核酸類物質(zhì)由外泌體在宿主細(xì)胞和受體細(xì)胞之間的傳遞可能影響了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，包括轉(zhuǎn)移等，如三陰型乳腺癌細(xì)胞外泌體在乏氧條件下通過傳遞miR-221/222基因簇促進(jìn)癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，遷移和侵襲能力加強(qiáng)[5]。巨噬細(xì)胞源性外泌體包裹miR-223對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響在于靶向PTEN激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)癌的侵襲[6]。本組前期實驗亦發(fā)現(xiàn)，胃癌中特異性表達(dá)的miR-106a富集于外泌體中，胃癌細(xì)胞源性外泌體包裹miR-106a可能與癌的腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]，但是對于TDEs-miR-106a-靶標(biāo)模式如何調(diào)控腹膜轉(zhuǎn)移以及參與腹膜轉(zhuǎn)移的哪一方面尚未完全闡明。

胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是一種器官特異性的轉(zhuǎn)移方式。腹膜微環(huán)境的構(gòu)建是打造適宜于腫瘤細(xì)胞種植的必要前提[7]。而腫瘤細(xì)胞可分泌外泌體，一定程度上充當(dāng)了先鋒或可以對腹膜局部微環(huán)境的構(gòu)建起一定的促成作用。腹膜是一層由表層的間皮構(gòu)成的屏障，生理上起著阻隔癌或其它感染源侵入的作用，但如果這種刺激長期存在就有可能使間皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，如長期腹膜透析的慢性腎臟病患者腹膜纖維化的發(fā)生就是由于間皮細(xì)胞的EMT[8]。目前，腫瘤轉(zhuǎn)移對間皮的影響尚未有詳細(xì)的報道。有限的研究顯示，間皮細(xì)胞MMT對間皮完整性的破壞、增殖凋亡紊亂、間質(zhì)性轉(zhuǎn)化的調(diào)控和誘導(dǎo)作用參與腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的構(gòu)建[9-10]。Li等[11]報道外泌體miR-21-5p自胃癌細(xì)胞分泌后，被人腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)化，MGC-803、SGC-7901外泌體均可以導(dǎo)致間皮遷移能力增強(qiáng)，miR-21 mimic促進(jìn)該作用，inhibitor抑制該作用，且間皮細(xì)胞MMT導(dǎo)致裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移灶的增大。本實驗采用人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS富集外泌體，作用于間皮細(xì)胞HMrSV5，初步表明TDEs-miR-106a促進(jìn)間皮細(xì)胞表型改變，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖活力減弱。關(guān)于間皮細(xì)胞MMT的研究，文獻(xiàn)報道高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞分泌外泌體miR-1247靶向B4GALT3激活NF-κB通路，促使肺正常纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)，活化的CAFs進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子IL-6/8促進(jìn)腫瘤生長，形成肺轉(zhuǎn)移灶[12]。本實驗在TDEs-miR-106a的作用下，檢測miR-106a靶基因及MMT相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Smad7表達(dá)的同時伴隨上皮性標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)性標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)異常?？梢?，外泌體影響腫瘤轉(zhuǎn)移的過程應(yīng)包含傳遞miR-106a誘導(dǎo)間皮間質(zhì)化的步驟。

Smad7是TGF-β/Smad信號通路的抑制因子，參與TGF-β應(yīng)答反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[13]。為驗證TDEs-miR-106a是否通過該靶點對間皮細(xì)胞產(chǎn)生功能調(diào)控作用，本實驗采用TGF-β干預(yù)檢測間皮細(xì)胞表型、功能和MMT蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：TGF-β明顯減弱HMrSV5細(xì)胞增殖活力，并促使間質(zhì)標(biāo)志物SMA、Fibronectin表達(dá)升高，說明TGF-β信號參與調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞表型。以上作用在合并外泌體TGF-β抑制劑處理后，可見部分恢復(fù)HMrSV5細(xì)胞的增殖和MMT轉(zhuǎn)化。此外，從逆向思維證實，Smad7的過表達(dá)也使得間質(zhì)性標(biāo)志物SMA、Fibronectin表達(dá)下降，間皮的遷移能力減弱，部分逆轉(zhuǎn)了間皮在TDEs-miR-106a作用下所發(fā)生的表型和MMT改變。進(jìn)一步說明外泌體介導(dǎo)miR-106a靶向Smad7調(diào)控間皮細(xì)胞MMT，參與腹膜轉(zhuǎn)移的過程。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤性疾病發(fā)展到頂峰的極盛狀態(tài)。外泌體實驗結(jié)果初步證實其作為一種必要的介質(zhì)為胃癌細(xì)胞和腹膜之間的“對話”搭建了橋梁，有可能在一定程度上促成了種植反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明，TDEs-miR-106a-Smad7的構(gòu)成模式可能通過調(diào)控間皮細(xì)胞MMT，參與促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。