精神分裂癥“二次打擊”小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

尤鵬升，韋 暉，許 琪

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

精神分裂癥(schizophrenia)是一種高異質(zhì)性的重癥精神疾病。流行病學(xué)結(jié)果顯示，精神分裂癥多發(fā)于青春期晚期或成年早期，人群終生患病率約為1%[1]，男女患病率基本相同，但男性患者普遍發(fā)病年齡較早，癥狀更加嚴(yán)重。

The first hit was composed of maternal immune activation by poly I:C on gestation day 9.5; control mother received corresponding vehicle solution; offspring born to Poly I:C-treated(MIA) or vehicle-treated(CON) mothers were weaned on postnatal day 21; then they were exposed to poly I:C or saline on gestation 21 or 42 as the second hit; behavioral assessment took place when the animals reached postnatal day 56

精神分裂癥的神經(jīng)發(fā)育假說認(rèn)為，生命早期的大腦發(fā)育缺陷積累是該疾病的重要病因?qū)W基礎(chǔ)之一[2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，母體妊娠期間感染風(fēng)疹、弓形蟲、流感病毒等會(huì)增加子代精神分裂癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。在妊娠中期向母鼠注射聚肌胞苷酸(polyinosinin-polycytidylic acid, polyⅠ:C)或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，模擬病毒感染的炎性反應(yīng)，子代成年后表現(xiàn)出精神分裂癥樣的表型[4]。青春期也是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，青春期的不良事件是精神分裂癥的高危風(fēng)險(xiǎn)因素之一?；诹餍胁W(xué)、精神分裂癥復(fù)雜的遺傳學(xué)以及延遲發(fā)病的現(xiàn)象，有人提出精神分裂癥的“二次打擊”假說[5]，認(rèn)為產(chǎn)前感染和產(chǎn)后應(yīng)激具有累積效應(yīng)，也就是說圍產(chǎn)期感染使發(fā)育中的大腦對(duì)青春期的不良事件更為敏感，增加了大腦的脆弱性[6]，從而增加子代患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在探究孕期感染和產(chǎn)后炎性反應(yīng)對(duì)精神分裂癥的發(fā)生是否具有協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)成年C57BL/6J雄鼠10只，雌鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(合格證號(hào):110324200102749567、110324200102750947)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)為5只/籠，溫度區(qū)間為20 ℃～24 ℃，濕度區(qū)間為50%～70%，光照時(shí)間為8∶00～20∶00，自由飲水?dāng)z食。

1.1.2 主要試劑：polyinosinin-polycytidylic acid和地佐環(huán)平(Sigma-Aldrich公司)；Mouse IL-6、IL-10和TNF-α試劑盒(R&D公司)；FastStart Essential DNA Green Master(Roche公司)；Trizol(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 “二次打擊”模型的建立(圖1)：9周齡雌鼠與雄鼠2∶1合籠過夜，次日取出雄鼠，雌鼠記為GD 0.5。孕鼠于GD 9.5[7]時(shí)隨機(jī)分成兩組，按照10 mg/kg單次腹腔注射poly I:C或0.9%氯化鈉溶液，子代小鼠分別為母體免疫激活(maternal immune activation, MIA)小鼠和對(duì)照小鼠。子代小鼠生長(zhǎng)至3周時(shí)雌雄分籠，分別于3周(齡)、6周(齡)時(shí)第2次注射poly I:C(10 mg/kg)或0.9%氯化鈉溶液。小鼠正常飼養(yǎng)至8周行為學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)炎性因子: 小鼠注射poly I:C或0.9%氯化鈉溶液，分別在注射后3、12、24 h共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血靜置，離心后吸取上層無色透明血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照ELISA檢測(cè)說明書進(jìn)行抗體包被、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品檢測(cè)，利用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)450 nm以及540 nm處記錄吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，計(jì)算血清中IL-6、IL-10以及TNF-α的濃度。

1.2.3 RNA提取與基因表達(dá)量的檢測(cè)：取新鮮海馬和皮層組織，利用Trizol勻漿和氯仿分層法分離RNA。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將600 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。

1.2.4 行為學(xué)檢測(cè): 前脈沖抑制(prepulse inhibition, PPI)和MK-801誘導(dǎo)的自發(fā)活動(dòng)是精神分裂癥模型評(píng)定的重要指標(biāo)。PPI：在25 min的測(cè)試過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受驚反射刺激、前脈沖刺激、前脈沖聯(lián)合驚反射刺激以及恒定背景噪聲(65 dB)的無刺激實(shí)驗(yàn)4種類型。驚反射刺激為120 dB，持續(xù)40 ms的白噪聲；前脈沖刺激為70、75、80以及85 dB的白噪聲。實(shí)驗(yàn)開始后，給予每只動(dòng)物5 min的適應(yīng)時(shí)間，之后每種類型的實(shí)驗(yàn)以假隨機(jī)的順序出現(xiàn)8次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)間的間隔為15～25 ms。

MK-801誘導(dǎo)的自發(fā)活動(dòng)：將實(shí)驗(yàn)小鼠放在礦場(chǎng)檢測(cè)箱(40 cm×40 cm×35 cm)，追蹤30 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)軌跡。取出小鼠，按5 mg/kg的劑量腹腔注射MK-801(0.025 μg/mL)后放回檢測(cè)箱，追蹤60 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)軌跡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 poly I:C誘導(dǎo)中樞及系統(tǒng)炎性反應(yīng)

注射poly I:C能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的系統(tǒng)及中樞炎性反應(yīng)(圖2)。注射后3 h血清中IL-6、IL-10以及TNF-α均顯著升高(P<0.001)，12 h后細(xì)胞因子的水平基本恢復(fù)正常，24 h后血清中的細(xì)胞因子水平完全恢復(fù)正常(圖2A～C)，炎性反應(yīng)消失。腦組織中IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平在poly I:C注射3 h后兩種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平均顯著上升，12 h后基本恢復(fù)正常水平，與血清中的變化趨勢(shì)相同(圖2D～H)。在海馬組織中，IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平分別為對(duì)照組的3.5倍和3.4倍(圖2D，E)；在皮層中，IL-6的mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組的6.6倍(圖2G)，而IL-1β沒有顯著變化(圖2H)。大腦中TNF-α mRNA表達(dá)水平在poly I:C注射12 h之內(nèi)一直處于升高的狀態(tài)，直到24 h后才恢復(fù)正常(圖2F, I)。

Pregnant mice were exposed to poly I:C or control vehicle(saline) solution on gestation 9.5, and the inflammatory cytokines in plasma(A-C), inflammatory mRNA transcripts in hippocampus(D-F) and cerebral cortex(G-I) were measured 3，12 and 24 hours post-treatment；plasma: A.IL-6; B.IL-10; C.TNF-α; hippocampus: D.IL-6; E.IL-1β; F.TNF-α; cerebral cortex: G.IL-6, H.IL-1β,I.TNF-α; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group

2.2 MIA組中雌性比雄性表現(xiàn)出更強(qiáng)的精神分裂癥表型

MIA組小鼠在前脈沖聲強(qiáng)為75、80以及85 dB時(shí)，驚反射抑制率較對(duì)照組顯著降低(圖3A,B)。MIA組小鼠注射MK-801后自發(fā)活動(dòng)較對(duì)照組明顯增加，雄鼠在80、85以及90 min時(shí)顯著升高；雌鼠在55～90 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)水平顯著升高(圖3C,D)。

在4種不同的前脈沖聲強(qiáng)刺激下，雄性對(duì)照組小鼠的驚反射抑制率較雌性小鼠沒有明顯差異，但在前脈沖聲強(qiáng)為80、85 dB時(shí)，MIA組雌性小鼠的前脈沖抑制率較雄性小鼠顯著降低(圖3A)。MK-801的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組注射MK-801后，雌性小鼠和雄性小鼠間自發(fā)活動(dòng)沒有明顯差異，但是MIA組小鼠60～75 min時(shí)，雌性小鼠的自發(fā)活動(dòng)明顯高于雄性小鼠(圖3C)。

A.sensorimotor gating as assessed by PPI of the acoustic startle reflex; PPI as a function of increasing prepulse intensities(dB above background of 65 dB)； *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with male control(saline-saline)； #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with female control(saline-saline); B.startle amplitude in 120 dB; C.locomotor reaction to the non-competitive NMDAR receptor antagonist dizocilpine； the line plot showed the distance moved in an open field arena to initial non treatment and subsequent MK-801 treatment as a function of successive 5-min bins； #P<0.05 reflecting the significant difference between male and female group; D.mean distance moved in the open field after administration of MK-801

2.3 poly I:C的“二次打擊”減弱MIA小鼠的精神分裂癥表型

在雄性小鼠中，MIA組小鼠前脈沖抑制率明顯降低，青春期單次注射poly I:C的小鼠在前脈沖聲強(qiáng)為80、85 dB時(shí)，其驚反射抑制率較對(duì)照組也顯著降低(圖4A)，而成年早期注射Poly I:C的雄鼠則無明顯變化(圖4B)。產(chǎn)前感染聯(lián)合青春期炎性的“二次打擊”之后，小鼠的前脈沖抑制率與對(duì)照組相比反而沒有明顯變化(圖4A,B)。雌性小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與雄性小鼠基本一致，MIA組小鼠以及青春期感染的小鼠在前脈沖聲強(qiáng)為75、80 dB時(shí)，其驚反射抑制率較對(duì)照組均具有顯著差異(圖4C)。當(dāng)青春期受到“二次打擊”后，小鼠在70、85 dB處的驚反射抑制率較對(duì)照組顯著降低(圖4C)。成年早期的“二次打擊”使小鼠在70、80、85 dB時(shí)的驚反射抑制率顯著下降(圖4D)，但也沒有孕期感染單次打擊造成的表型明顯。

Sensorimotor gating as assessed by PPI of the acoustic startle reflex; PPI as a function of increasing prepulse intensities(dB above background of 65 dB); the effects of single or combined exposure to prenatal immune activation and prepubertal inflammation or early adulthood inflammation on sensorimotor gating in male or female mice; A.prepubertal inflammation in male; B.early adulthood inflammation in male; C.prepubertal inflammation in female; D.early adulthood inflammation in female; *P<0.05, **P<0.01 compared with saline-saline group

3 討論

流行病學(xué)和動(dòng)物模型表明孕期感染和青春期的不良事件均是精神分裂癥的高危風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。本實(shí)驗(yàn)通過單次或兩次注射poly I:C建立精神分裂癥的“二次打擊”小鼠模型，發(fā)現(xiàn)孕期感染和青春期或成年早期炎性的聯(lián)合打擊并不能加劇小鼠精神分裂癥的表型，反而有一定的緩解作用，表明兩者間不存在累加效應(yīng)。

類似的現(xiàn)象也有報(bào)道，青春期單只飼養(yǎng)的小鼠會(huì)表現(xiàn)出過度活躍、海馬和皮層細(xì)胞因子水平升高、記憶和學(xué)習(xí)功能受損等表型，而妊娠期注射poly I:C再單只飼養(yǎng)的小鼠非但沒有加重上述表型，反而緩解了因?yàn)楦綦x而產(chǎn)生的一系列行為和細(xì)胞因子變化[9]。此外，通過產(chǎn)前免疫應(yīng)激(妊娠第9天單次注射poly I:C)聯(lián)合青春期壓力應(yīng)激(電足、束縛、水剝奪以及重復(fù)更換籠具)建立精神分裂癥的“二次打擊”模型，發(fā)現(xiàn)孕期感染增加了子代對(duì)壓力應(yīng)激變化的脆弱性，也就是說母體免疫激活與青春期壓力應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生協(xié)同的病理效應(yīng)[7]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)青春期的壓力應(yīng)激并不能加劇孕期感染造成的行為變化[10]?！岸未驌簟钡难芯拷Y(jié)果如此大相徑庭，究其原因可能是由于孕期感染的時(shí)間、劑量以及第二次打擊的方式不同造成的?，F(xiàn)有研究中，孕期感染的時(shí)間從GD 9-17不等，部分研究采用多種社會(huì)壓力應(yīng)激作為二次打擊，包括隔離飼養(yǎng)、電足、束縛等不良事件，而另一部分研究采用炎性應(yīng)激，包括注射poly I:C或LPS[11]。

本研究通過圍產(chǎn)期和青春期poly I:C的注射建立精神分裂癥的小鼠模型，明確母體免疫激活的小鼠較“二次打擊”的小鼠具有更明顯且穩(wěn)定的行為學(xué)改變。相較于“二次打擊”模型的不確定性，母體免疫激活的子代動(dòng)物能夠穩(wěn)定的表現(xiàn)出精神分裂癥的核心癥狀[12]：感覺運(yùn)動(dòng)門控障礙、焦慮增加以及MK-801的敏感性增強(qiáng)，而且這些行為改變多數(shù)可以通過抗精神病藥物得到減輕，如氯氮平、奧氮平等。因此，母體免疫激活模型依然是研究精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制、新藥篩選的首選模型。