氣相色譜測定甜蜜素方法的優(yōu)化及探究

◎ 何焜鵬，陳麗香，黃日梅

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

甜蜜素，化學名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，屬于非營養(yǎng)型合成甜味劑，其甜度為蔗糖的30～80倍[1]，在飲料、蜜餞、醬菜、配制酒等各類食品中廣泛使用，而甜蜜素價格僅為蔗糖的1/3，經常食用甜蜜素含量超標的飲料或其他食品，會因攝入過量對人體的肝臟和神經系統(tǒng)造成危害，特別是對代謝排毒能力較弱的老人、孕婦、兒童危害更明顯[2-4]。目前檢測甜蜜素的方法主要參照GB 5009.97—2016中氣相色譜法測定，前處理煩瑣，容易污染色譜系統(tǒng)，多次進樣后色譜柱分離性能變差，出峰位置會受到雜峰干擾，色譜柱壽命變短。采用頂空進樣的方式，可減少復雜基質對色譜系統(tǒng)的污染，利用亞硝酸鹽在強酸的環(huán)境中，生成的亞硝酸與環(huán)己基氨基磺酸發(fā)生重氮化反應，生成化合物，經過氣相質譜定性其成分為環(huán)己烯[5]，通過測定其含量進行定量分析，簡單高效，結果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B氣相色譜儀（配置FID檢測器，安捷倫科技有限公司）、渦旋振蕩器（德國IKA公司）；離心機（曦瑪離心機（揚州）有限公司）、G1888頂空進樣器（安捷倫科技有限公司）、數顯型振蕩搖床（德國IKA公司）及氣相色譜質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）。

環(huán)己基氨基磺酸鈉標準品，純度≥99.9%，Dr. Ehrenstorfer生產；硫酸和亞硝酸鈉，分析純，廣州化學試劑廠生產；實驗室用水為Milli-Q一級超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

硫酸溶液（200 g·L-1）：量取54 mL硫酸小心緩緩加入400 mL水中，后加水至500 mL，混勻。

亞硝酸鈉溶液（50 g·L-1）：稱取25 g亞硝酸鈉，溶于水并稀釋至500 mL，混勻。

環(huán)己基氨基磺酸標準儲備液：準確稱取0.561 2 g環(huán)己基氨基磺酸鈉標準品，用一級純水溶解后定容至100 mL，混勻后此時得5 mg·mL-1的環(huán)己基氨基磺酸溶液（環(huán)己基氨基磺酸鈉與環(huán)己基氨基磺酸的換算系數為0.890 9）。

1.2.2 樣品前處理

液體試樣：搖勻樣品，稱取25 g（精確到0.001 g），置于50 mL比色管，用水定容至刻度線待衍生化；固體試樣：樣品粉碎均勻后，稱取5 g（精確到0.001 g），置于50 mL的離心管，加入20 mL水超聲30 min，8 000 r·min-1離心3 min，將水相轉移至50 mL比色管，分3次每次10 mL洗滌殘渣后，用水定容至刻度線。

1.2.3 衍生化

取樣液5 mL于頂空瓶，加入2 mL硫酸溶液、2 mL亞硝酸鈉溶液后，馬上密封頂空瓶。以2 000 r·min-1低速渦旋1 min混勻，待頂空上機測定。

1.2.4 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫升溫程序：60 ℃保持8 min；進樣口溫度：230 ℃；進樣量：1 mL；分流進樣，分流比5∶1，分流流量為12 mL·min-1；氫火焰離子化檢測器（FID）：溫度250 ℃，氫氣 40 mL·min-1；空氣 350 mL·min-1；尾吹30 mL·min-1；載氣：高純氮氣；尾吹 20 mL·min-1。頂空條件：平衡溫度50 ℃，定量環(huán)溫度90 ℃，傳輸線區(qū)溫度100 ℃。

2 結果與分析

2.1 測定化合物分析

本實驗利用亞硝酸鈉在酸性環(huán)境下與甜蜜素反應生成衍生物環(huán)己烯，以環(huán)己烯作為對目標化合物進行定量定性分析。甜蜜素標準溶液衍生物環(huán)己烯的色譜圖見圖1，通過與空白樣品的比較，其保留時間為2.209 min。該化合物經過氣相色譜質譜聯用儀測定，確定該目標物為環(huán)己烯見圖2。

圖1 環(huán)己烯的氣相色譜圖

圖2 環(huán)己烯質譜圖

2.2 目標化合物的提取方式選擇

實驗研究了超聲提取和振蕩提取目標化合物的方法，超聲提取的方法見1.2.2，振蕩提取的方式是樣品置于50 mL離心管，加入20 mL水，置于數顯型振蕩搖床，振蕩30 min，同時用GB 5009.97—2016第一法測定，以市購的一款果凍（標簽含甜蜜素）平行測定6次進行檢測分析，測定值見表1。從數據得知超聲提取測得值與國家標準方法（簡稱國標）測得值接近，振蕩提取測得值與國標結果偏差較大，因此本方法將采用超聲的方式提取。

表1 不同提取方式測定果凍中甜蜜素的值表（n=6）

2.3 頂空平衡溫度與平衡時間選擇

配制5個標準濃度點，濃度均為50 μg·mL-1，控制頂空平衡時間為30 min。頂空進樣器可設置的平衡溫度范圍為40～230 ℃，樣品為水溶液，當設置平衡溫度過高時，頂空瓶內壓力升高或者樣品沸騰，可能導致頂空瓶內樣品內氣體泄漏或者頂空瓶破裂等情況，故本試驗在40～80 ℃進行試驗探究。統(tǒng)計在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃平衡溫度下相同濃度標準點的響應值，用于探究本實驗較優(yōu)的頂空平衡溫度，測試結果見圖3。配制5個標準濃度點，濃度均為50 μg·mL-1，控制頂空平衡溫度為50 ℃，標準濃度點在平衡時間為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min下進行測試，統(tǒng)計在不同平衡時間下相同濃度的標準濃度響應值，用于探究較優(yōu)的平衡溫度，測試結果如圖4。從圖3和圖4可得知，當平衡溫度為50 ℃時，環(huán)己烯達到最大的響應值；當平衡時間為30 min時，環(huán)己烯達到最大的響應值。因此，本方法將頂空平衡溫度為50 ℃，頂空平衡時間為30 min作為本方法的頂空條件。

圖3 頂空平衡溫度與響應值關系圖

圖4 頂空平衡時間與響應值關系圖

2.4 方法的線性范圍及檢出限

從環(huán)己基氨基磺酸標準儲備液（5 mg·mL-1）中分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL和2 mL用純水定容至 50 mL，配制成 10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 200 μg·mL-1的 標 準 工作使用液。吸取5 mL于頂空瓶，按1.2.3衍生化，上機測定。以標準工作液濃度為橫坐標，環(huán)己烯峰面積為縱坐標，繪制校正曲線見圖5，線性回歸方程為Y=1.201 0X-1.686 0，線性擬合R=0.999 8，線性良好，符合GB/T 27404—2008相關系數的要求。將標準品儲備液逐級稀釋，以信噪比S/N=3時的濃度為本方法的檢出限，為0.06 μg·mL-1，S/N=10時的濃度為本方法的定量限，為 0.2 μg·mL-1。

圖5 環(huán)己烯的校正曲線圖

2.5 樣品加標回收實驗和重復性實驗

從市場購得的多種樣品在3個不同添加水平下進行加標回收實驗和精密度實驗，結果見表2。

表2 不同基質不同添加濃度下甜蜜素的回收率和精密度表（n=6）

甜蜜素在不同添加水平下的回收率為95.6%～104.0%，相對標準偏差為0.3%～3.5%，符合《實驗室質量控制范圍 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中回收率和精密度的要求。

2.6 檢測標準的測定結果比對

從市場購得的多種樣品，將本方法結果與GB 5009.97—2016第一法氣相色譜法的結果進行比較，平行測定6次。統(tǒng)計數據，確認本方法與標準方法的結果是否有較大差異，結果見表3。從數據得知，在不同基質下，本方法的結果與標準方法相近，相對偏差較小，能滿足檢測的要求。

表3 多種基質在不同方法下的測定值表（n=6）

3 結論

本方法采用頂空進樣方式測定甜蜜素，建立了以環(huán)己烯作為目標物進行測定的方法。對樣品提取方式、頂空條件的選擇、樣品回收率及測定穩(wěn)定性等方面進行了探究。改進了GB 5009.97—2016第一法的前處理步驟。采用頂空進樣方式，減少了各種基質中脂類、糖分、蛋白質等物質對色譜系統(tǒng)的污染。目標化合物的線性相關系數良好、樣品的加標回收率在正常范圍內、精密度小，符合GB/T 27404—2008中的要求。本方法簡單高效，適用于檢測食品中甜蜜素含量的檢測。