評(píng)定超高效液相色譜法測(cè)定山桐子油中苯并(a)芘(BaP)的不確定度*

單曉雪 姜 濤 張宇沖 廖子龍 楊 娟 劉曉莉

(中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司 610081)

苯并(a)芘(BaP)是苯與芘稠合而成的一類多環(huán)芳烴，具有明顯致癌作用[1～2]。它在環(huán)境中存在廣泛，以食用油為例，BaP主要來(lái)自外環(huán)境污染和加工過(guò)程高溫烘烤、壓榨[3～4]。近年來(lái)，我國(guó)已將植物油列入食品安全監(jiān)督抽查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)監(jiān)控食品。針對(duì)BaP的檢測(cè)引入不確定度，對(duì)于質(zhì)量控制有著重要的意義[5]。檢測(cè)結(jié)果的不確定度可以反映被測(cè)量值的分散性，置信度區(qū)間的半寬度[6]。本文針對(duì)BaP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度的評(píng)定和計(jì)算[7～9]，為評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用的山桐子油樣品為本實(shí)驗(yàn)室某次檢驗(yàn)余樣；BaP標(biāo)準(zhǔn)品純度大于等于98%；BaP分子印跡柱；乙腈色譜級(jí)，正己烷色譜級(jí)；二氯甲烷分析純；超高效液相色譜儀1290配FID檢測(cè)器；旋蒸儀；純水儀；電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并(a)芘的測(cè)定》(GB5009.27-2016)的要求，對(duì)試樣中BaP的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1 樣品處理 用5 mL正己烷對(duì)試樣進(jìn)行溶解，渦旋混合0.5 min，全部加入已經(jīng)活化好的印跡小柱里，移取6 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液，再用10 mL二氯甲烷洗脫并收集凈化液，40℃旋蒸至凈干，最后準(zhǔn)確移取乙腈5 mL復(fù)溶，過(guò)0.15 μm的濾膜，裝瓶上機(jī)待測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中BaP的含量。

1.2.2 標(biāo)液的配置 稱取BaP標(biāo)品11.2 mg，用乙腈配置成11.2 μg/mL的貯備液，再逐級(jí)稀釋到濃度為0.56 ng/mL，1.12 ng/mL，5.60 ng/mL，11.2 ng/mL，22.4 ng/mL五個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.3 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈∶水=90∶10；北京Dikmatech C18色譜柱(Endeavorsil 1.8 μm.2.1 μm×50 mm)，流速：0.350 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：5 μL；檢測(cè)器：FID，激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm。

2 數(shù)學(xué)建模和不確定度來(lái)源分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

BaP含量計(jì)算按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，結(jié)果以μg/kg表示，保留小數(shù)點(diǎn)后一位，其數(shù)學(xué)模型為

式中:X為試樣中BaP的含量(μg/kg)；ρ為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品待測(cè)液的濃度(ng/mL)；V試樣最終定容體積(mL)；m為秤樣質(zhì)量(g)；

2.2 BaP含量不確定度的來(lái)源分析

對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，不確定度來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面：(1)樣品前處理產(chǎn)生的不確定度；(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度；(4)樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的不確定度；(5)樣品回收率產(chǎn)生的不確定度。

3 不確定度分量的評(píng)定

3.1 樣品前處理產(chǎn)生的不確定度

樣品前處理中不確定度來(lái)源于稱量、移液、定容。

3.1.2 樣液移液和定容引起的不確定度 實(shí)驗(yàn)中需要用移液管準(zhǔn)確移取5 mL乙腈定容上機(jī),該移液管重復(fù)移取10次的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.22×10-3。量具檢定的實(shí)際容量偏差分為0.022 mL，因移取的試劑的不同，采用對(duì)應(yīng)試劑的膨脹系數(shù)，在實(shí)驗(yàn)室溫度20℃±5℃下，進(jìn)行校準(zhǔn)，乙腈膨脹系數(shù)為1.37×10-3(1/℃)，數(shù)據(jù)見表1。

表1 樣液使用1次的移取和定容引起的不確定度

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量，標(biāo)液的配置三個(gè)方面。

表2 標(biāo)液移取和定容引起的不確定度

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

對(duì)每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積及其平均值數(shù)據(jù)見表3，采用最小二乘對(duì)每個(gè)濃度峰面積的平均值與濃度進(jìn)行擬合，得到擬合方程Y=21.911X-3.5508，R2=0.99969(式中，Y為峰面積，X為BaP濃度，b=21.911為擬合曲線斜率，a=3.5508為擬合曲線截距)。

表3 每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液六次重復(fù)進(jìn)樣的峰面積

擬合曲線求樣品溶液中BaP平均濃度C產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

式中：s(A)——標(biāo)準(zhǔn)曲線殘余偏差為：

C0——樣品溶液的平均質(zhì)量濃度11.9124 ng/mL；

Xi——對(duì)應(yīng)第i標(biāo)液的擬合濃度ng/mL；

N——樣品平行測(cè)定次數(shù)，N=6；

n——標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，n=5×6=30；

b——為擬合曲線斜率；

3.4 提取效率因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.4.1 樣品檢測(cè)重復(fù)性因素引起的不確定度 重復(fù)稱量6次樣品，在同一條件下進(jìn)行檢測(cè)，得到的結(jié)果見表4。

表4 樣品6次重復(fù)測(cè)定結(jié)果

運(yùn)用spss22.0，用數(shù)據(jù)對(duì)比檢測(cè)平均值進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，sig.(2-tailed)值為0.929，>0.05，說(shuō)明6次結(jié)果與平均值無(wú)明顯差異，故采用A方法評(píng)定，重復(fù)性相對(duì)不確定度為

3.4.2 加標(biāo)回收引起的不確定度 重復(fù)稱量6次樣品，根據(jù)之前測(cè)定的樣品本底含量，做加標(biāo)回收，結(jié)果見表5。

表5 樣品加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果

由于樣本量少，運(yùn)用spss22.0，對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，sig.(2-tailed)值為0.994，>0.05，說(shuō)明回收率與均值之間沒(méi)有顯著性差異，可以不必帶入回收校正因子，故采用A方法評(píng)定，回收率的相對(duì)不確定度為：

4 測(cè)量不確定度的評(píng)定

4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)上訴不確定度分量的分析，合成不確定度Urel(X)的公式如下：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和各分量不確定度占比見表6。

表6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和各分量不確定度占比

4.2 相對(duì)擴(kuò)展不確定度評(píng)價(jià)

取包含因子k=2，置信概率為95%，則高效液相色譜法測(cè)量BaP的相對(duì)不確定度為Urel=K×Urel(X)=2×0.0466=0.0932。

4.3 擴(kuò)展不確定度

5 結(jié)論與討論

本文對(duì)超高效液相色譜法測(cè)定，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算山桐子油中BaP含量，對(duì)影響測(cè)量結(jié)果的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析，并對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)定。綜上得出，桐子油樣品中BaP含量測(cè)定結(jié)果X=(39.1±3.6)μg/kg，k=2。影響B(tài)aP測(cè)定結(jié)果的因素主要是是標(biāo)準(zhǔn)曲線占比47.99%，其后依次為標(biāo)準(zhǔn)溶液配置占比20.67%，方法重復(fù)性占比8.85%，方法回收率占比8.58%，標(biāo)準(zhǔn)品稱量占比6.29%，樣品前處理占比5.50%，標(biāo)準(zhǔn)品純度和樣品稱量帶來(lái)的不確定度占比最小，分別為1.75%和0.37%，這和眾多相關(guān)不確定度研究結(jié)果類似[10～12]。要降低不確定度，就要從標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，嚴(yán)格規(guī)范標(biāo)液配制操作開始。標(biāo)液要保存得當(dāng)，定期核查。上機(jī)過(guò)程中儀器是否穩(wěn)定，樣品前處理時(shí)人員操作水平是否一致，操作是否規(guī)范，目標(biāo)物質(zhì)提取是否達(dá)充分，都是影響方法重復(fù)性和回收率的因素[13]。故實(shí)驗(yàn)室中的儀器檢定、期間核查和人員比對(duì)就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)室的精確儀器如容量瓶、移液管等，也應(yīng)定期校準(zhǔn)和檢定。標(biāo)品在采購(gòu)時(shí)，純度示值和不確定度應(yīng)該值得關(guān)注，把控好標(biāo)品的存放條件可以降低標(biāo)品純度的不確定度。稱量?jī)x器如不同量程的天平除了定期檢定，日常的清理和維護(hù)也是保持其精密度的措施之一。