基于SRAP的辣木種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

林宗鏗 張?zhí)煜? 楊俊杰

摘 ?要：為探討辣木（Moringa spp.）種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，采用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）分子標(biāo)記方法對18份辣木種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從170對引物中篩選出13對多態(tài)性較高的引物組合，共擴(kuò)增出104條清晰穩(wěn)定的條帶，平均多態(tài)性條帶百分率達(dá)62.50%。遺傳多樣性參數(shù)分別為等位基因數(shù)（Na）為1.6250，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4777，基因多樣性指數(shù)（H）為0.2632，香農(nóng)信息指數(shù)（I）為0.3797，說明18份辣木種質(zhì)資源間有較高的遺傳多樣性。UPGMA聚類分析結(jié)果表明，18份辣木種質(zhì)資在遺傳相似系數(shù)0.732水平上，可分了3個(gè)群，來自非洲盧旺達(dá)的狹瓣辣木[M. stenopetala（Baker f.） Cufod.]具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，單獨(dú)聚類為一個(gè)類群Ⅲ;其余樣品則分別聚類為類群Ⅰ和類群Ⅱ，類群Ⅰ共11份材料，主要為來源于印度的多油辣木（M.?oleifera Lam.）及其改良種‘PKM1和‘PKM2，類群Ⅱ共6份材料，主要為來源于我國云南和海南的多油辣木及其改良種‘PKM1和PKM2。SRAP標(biāo)記反映了辣木種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，本研究結(jié)果為辣木雜交育種的親本選擇提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣木;SRAP;遺傳多樣性;親緣關(guān)系中圖分類號：Q949.748.5??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Assessment of Genetic Diversity and Relationship among 18 Moringa?Species Based on SRAP Marker

LIN Zongkeng， ZHANG Tianxiang， YANG Junjie

Fujian Institute of Tropical Crops， Zhangzhou， Fujian 363001， China

Abstract： Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker was used to analyze the genetic diversity and relationship among 18?Moringa species in this study. A total of 104 bands were amplified from 18 tested germplasm resources by 13 pairs of core primer combinations selected from 170 pairs of primers. The average percentage of polymorphism was 62.50%. Observed alleles were 1.6250， effective alleles were 1.4777， Neis gene diversity was 0.2632 and Shannons information index was 0.3797， which showed 18Moringaspecies existed high genetic diversity. According to Neis genetic similarity coefficient， when the genetic similarity coefficient was 0.732， theMoringagermplasms could be divided into three categories. Among the 18 germplasms， apart fromM. stenopetala（Baker f.） Cufod.， the rest materials were in category I or category II. Thereinto， category II contained 11 germplasms， mainly includingM. oleiferaLam.， its improved species ‘PKM1 and ‘PKM2， which derived from India. Besides，M. oleiferaLam.， its improved species ‘PKM1 and ‘PKM2 which came from Hainan and Yunnan， China were clustered into category II.M. stenopetala（Baker f.） Cufod. which came from Rwanda was clustered in group III， indicating this material had further relationship with others. SRAP molecular marker reflects the genetic relationship amongMoringaspecies and would provide a theoretical basis for the selection ofMoringa hybrid parents.

Keywords： Moringa; SRAP; genetic diversity; genetic relationships

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.005

辣木（Moringa spp.）為辣木亞目（Moringineae）辣木科（Moringaceae）辣木屬（MoringaAdans.）植物，是單科單屬植物^[1]。辣木原產(chǎn)于印度、巴基斯坦等南亞國家以及阿拉伯半島及非洲大陸，具有獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)保健作用。辣木各個(gè)部位如葉、花、果、種子等均可食用，特別是辣木葉含有較高的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分^[2-5]。辣木葉、花、果等部位還含有豐富的植物多糖、黃酮類、生物堿、酚類等多種活性成分，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎抑菌等作用，有較高的藥用價(jià)值^[6-8]。此外，辣木因生長迅速、主桿粗壯、株型圓滿、花期長、花量多等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于城市廣場綠化。辣木有13個(gè)種，其中只有4個(gè)種有栽培價(jià)值。常見種植的主要是多油辣木（M.?oleifera Lam.）和狹瓣辣木[M. stenopetala（Baker f.） Cufod.]2個(gè)種。多油辣木原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山脈，由于口感好，產(chǎn)量高，是目前世界上的主栽種。印度科研人員在多油辣木原種的基礎(chǔ)上，采用選擇育種和雜交育種方式分別培育出2個(gè)改良品種‘PKM1和‘PKM2，并在全世界得到推廣種植^[1，9]。狹瓣辣木原產(chǎn)于埃塞俄比亞和肯尼亞北部，葉片較大，芳香味濃，在非洲有較大面積栽培^[1]。近10 a來，隨著消費(fèi)群體對辣木營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值及功效的認(rèn)識逐漸深化，辣木在我國云南、廣西、海南、廣東、福建等熱帶、南亞熱帶地區(qū)得到了快速推廣種植^[10-13]，并在北方一些栽培設(shè)施內(nèi)也得到了推廣^[14]。

我國并非辣木原產(chǎn)地，目前國內(nèi)種植所需種子大部分是從境外進(jìn)口，小部分由國內(nèi)種植者自己采種。由于辣木在國內(nèi)大面積種植時(shí)間較短，沒有自主產(chǎn)權(quán)的辣木品種，辣木種子管理尚不規(guī)范，因而市場上辣木品種混雜，真假難分。國內(nèi)科研人員已著手進(jìn)行辣木選育種工作^[15]。辣木以雜交育種為主，親本間的遺傳關(guān)系將在很大程度上決定雜交F₁代種子的質(zhì)量。因而，將篩選出具有明顯表觀特征的辣木種質(zhì)資源，利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，是育種過程中重要的一環(huán)。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，多種DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源評價(jià)、遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建等方面，如限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism， RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA， RAPD）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）等^[16-17]。SRAP因具有較好的重復(fù)性、較強(qiáng)的多態(tài)性、共顯性標(biāo)記系統(tǒng)和操作簡便、成本低等特點(diǎn)，成為植物親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析的有效手段，已應(yīng)用于果樹、蔬菜、花卉等多種植物輔助育種研究中^[18-21]。目前，鮮見有關(guān)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于辣木種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析的研究報(bào)道。筆者自2012年起收集辣木種質(zhì)資源，建立了種質(zhì)資源圃，進(jìn)行試種觀測。本研究對辣木SRAP標(biāo)記的通用引物進(jìn)行篩選，對18份具有鮮明特征、擬作為育種親本的辣木種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，了解其遺傳背景，明確各材料間的親緣關(guān)系，為下一步進(jìn)行辣木雜交育種提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

供試材料均采自福建省熱帶作物科學(xué)研究所辣木種質(zhì)資源圃。資源圃的辣木種質(zhì)主要引自于中國云南、海南、廣東、臺灣，以及印度、泰國、緬甸、盧旺達(dá)等地。供試材料共18份，根據(jù)種（品種）名、引種地及特征進(jìn)行編號（表1），其中S6～S8尚不能確定品系歸屬。采集各供試材料的幼嫩葉片，裝入自封袋并編號，每袋20片葉子，加入硅膠，葉片充分干燥后保存于–80?℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1??總DNA的提取和檢測 ?辣木基因組DNA提取參考林藝華等^[22]的方法，采用天根高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350）進(jìn)行提取，總DNA采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白儀（Eppendorf BioPhotometer Plus）測定其濃度和質(zhì)量?；蚪MDNA條帶明亮，完整無降解。加入適量無菌水后將其稀釋至20?ng/?L，并置于–20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?PCR引物篩選及反應(yīng)體系 ?以種質(zhì)S1的DNA為模板，篩選17條上游引物（編號為A～Q），10條下游引物（編號為1～10），兩兩組成170對SRAP引物，引物序列見表2。SRAP-PCR擴(kuò)增總體積為25??L，其中包括不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5??L，Mg²⁺2?mmol/L，dNTPs 0.2?mmol/L，DNA濃度為2??L（20?ng/?L），TaqDNA聚合酶用量為0.625?U，上下游引物各0.75??mol/L。引物來源于生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR試劑來源于寶生物工程（大連）有限公司。

將上述SRAP-PCR反應(yīng)混合液按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94?℃預(yù)變性5?min;94?℃變性1?min，37?℃復(fù)性1?min，72?℃延伸1?min，5個(gè)循環(huán);94?℃變性1?min，50?℃復(fù)性1?min，72?℃延伸1?min，35個(gè)循環(huán);72?℃再延伸10?min，于4?℃下保存。

1.3數(shù)據(jù)處理

SRAP-PCR擴(kuò)增后采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，清晰、可重復(fù)且長度范圍在200～2000 bp內(nèi)的進(jìn)行記錄，對同一引物的擴(kuò)增條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建成原始表征0-1數(shù)據(jù)矩陣。SM相似系數(shù)利用NTSYS 2.1軟件中Similarity程序的Qualitative data計(jì)算，用Clustering程序中的SHAN進(jìn)行UPGMA聚類分析，繪制出聚類圖。辣木遺傳多樣性參數(shù)采用POPGENE?32計(jì)算，包括群體多態(tài)性位點(diǎn)百分率（P）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）。

2??結(jié)果與分析

2.1 ?SRAP引物篩選

采用已建立的辣木SRAP-PCR反應(yīng)體系和程序，通過引物篩選，從170對SRAP引物中篩選出13對具有較好多態(tài)性的引物，分別為A6、F1、F2、F3、G3、I4、I8、M2、M3、P7、P8、Q1和Q2（表3）。其中，L1～L10和M1～M10引物擴(kuò)增辣木種質(zhì)S1的結(jié)果如圖1所示。

2.2擴(kuò)增多態(tài)性及遺傳多樣性分析

用13對SRAP引物對18份辣木樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總共獲得104條擴(kuò)增帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為65條，平均多態(tài)性條帶百分率為62.50%。采用POPGENE軟件對SRAP分子標(biāo)記方法擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，等位基因數(shù)（Na）為1.6250，基因多樣性指數(shù)（H）為0.2632，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4777，Shannon信息指數(shù)（I）為0.3797。說明試驗(yàn)所用18份辣木種質(zhì)資源間有較豐富的遺傳多樣性。

2.3辣木親緣關(guān)系分析

根據(jù)SRAP分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，形成0-1矩陣，進(jìn)而通過NTSYS 2.1軟件對該數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析?；赟RAP分子標(biāo)記的聚類結(jié)果表明（圖2），在相似系數(shù)為0.62處時(shí)，S14單獨(dú)聚類為1個(gè)分支，為來自于非洲盧旺達(dá)的狹瓣辣木。在相似系數(shù)為0.732處，另外17份辣木材料分為2類，I類為S1～S11，共11份材料;Ⅱ類為S12～S13、S15～S18，共6份材料。I類群的11份材料主要為來源于印度的多油辣木及其改良種‘PKM1和‘PKM2，Ⅱ類群的6份材料主要為來源于我國云南和海南的多油辣木及其改良種‘PKM1和‘PKM2。

3??討論

分子標(biāo)記技術(shù)是DNA水平上遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制，遍及整個(gè)基因組，遺傳穩(wěn)定，能夠克服形態(tài)學(xué)鑒定的很多困難。利用分子標(biāo)記對辣木遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析對育種工作中親本的選擇具有重要指導(dǎo)意義。已有研究表明，辣木種間、種內(nèi)不同個(gè)體間存在著豐富的遺傳多樣性。韓闖等^[23]利用ISSR標(biāo)記對7個(gè)不同種的辣木材料進(jìn)行了分析，將7份材料聚為4類，認(rèn)為同種辣木植物的樣品間遺傳距離相對較小，不同種的辣木遺傳距離較遠(yuǎn)。李海渤等^[24]采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對同一品種內(nèi)78株不同形態(tài)特征的辣木遺傳多樣性進(jìn)行了研究，將參試材料劃分為4個(gè)大類，并認(rèn)為參試材料雖為同一品種但單株間差異大，遺傳背景豐富，不同形態(tài)特征與遺傳無關(guān)，可能是環(huán)境變化或營養(yǎng)組分的差異所致。魏靜^[25]應(yīng)用SSR標(biāo)記對多油辣木種內(nèi)10個(gè)種源進(jìn)行了分析，也認(rèn)為各種源內(nèi)存在廣泛的變異，個(gè)體層次的遺傳背景豐富。鄭碩理等^[26]采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對27份在云南省栽培的辣木遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)來自同一栽培區(qū)域、具有相同性狀的材料沒有按預(yù)期聚類在一起，因而認(rèn)為栽培辣木種群內(nèi)遺傳分化較大。林藝華等^[27]曾利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了16份辣木種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。

不同分子標(biāo)記在辣木種質(zhì)資源的分析中各具特點(diǎn)，SSR和AFLP標(biāo)記都存在費(fèi)用較高的問題，RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性和重復(fù)性差，ISSR對PCR擴(kuò)增的最適條件要求嚴(yán)格。SRAP標(biāo)記是基于PCR的一種新型標(biāo)記系統(tǒng)，通過一對引物對開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，在設(shè)計(jì)引物時(shí)正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區(qū)與變異大的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列，因此多數(shù)SRAP標(biāo)記在基因組中分布均勻^[18]。SRAP標(biāo)記具有簡便、高效、重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為最有可能大規(guī)模應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種的一種技術(shù)。唐源江等^[28]應(yīng)用SRAP標(biāo)記技術(shù)對48個(gè)葉子花品種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，將試驗(yàn)材料分為4個(gè)類群，認(rèn)為SRAP標(biāo)記可較好地反映葉子花種質(zhì)間的遺傳關(guān)系。張安世等^[29]采用SRAP標(biāo)記技術(shù)對18份皂莢種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，認(rèn)為種質(zhì)間的遺傳多樣性水平存在顯著差異，具有豐富的遺傳變異。

本研究利用SRAP標(biāo)記對18份辣木品系進(jìn)行分析，群體多態(tài)性條帶百分率達(dá)62.50%，說明本試驗(yàn)篩選的引物可以有效地應(yīng)用于辣木種質(zhì)資源間遺傳多樣性分析。同樣，基因多樣性指數(shù)（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.2632、1.4777、0.3797，處于較高水平，說明供試材料間在分子水平上存在較為豐富的遺傳多樣性。本研究對常見種植的多油辣木和狹瓣辣木2個(gè)種共18份材料進(jìn)行了分類。從聚類結(jié)果的整體來看，與傳統(tǒng)的分類基本類似。不同種的辣木具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，參試材料狹瓣辣木單獨(dú)為一類，與其他17份屬于多油辣木種的參試材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。聚類結(jié)果還顯示，18份辣木種質(zhì)資源的類型劃分與其地域來源有一定的關(guān)聯(lián)性，來源于非洲、印度、中國的辣木自成一類群。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一品系內(nèi)出現(xiàn)嫩梢不同顏色、果莢變長和小葉片增大等形態(tài)學(xué)變異并不能與分子標(biāo)記結(jié)果相對應(yīng)。如多油辣木中S9和S10親緣關(guān)系較近，均來源于印度，嫩葉分別表現(xiàn)為紅色和綠色;S17和S18親緣關(guān)系較近，均來源于海南，嫩葉分別表現(xiàn)為綠色和紅色，未按性狀特征聚類?！甈KM2品系中表現(xiàn)出同樣的現(xiàn)象。說明這些形態(tài)學(xué)變異可能是由于環(huán)境變化或體內(nèi)營養(yǎng)成分不同引起。研究結(jié)果表明，來源于緬甸、泰國和中國臺灣的3個(gè)未知品系與改良種‘PKM系列具有較近的親緣關(guān)系，這與筆者之前利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記分析的結(jié)果類似^[26]，這3個(gè)國家或地區(qū)在地理位置上靠近印度，其種源很可能來自印度。研究結(jié)果表明SRAP分子標(biāo)記適用于辣木種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，研究結(jié)果為辣木種質(zhì)資源雜交育種親本選擇提供了理論依據(jù)。

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