逆境信號下木薯MeMYC2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及功能分析

于曉玲 郭鑫 李淑霞 阮孟斌 彭明

摘? 要：MYC2是茉莉酸信號途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，在植物生長發(fā)育及逆境信號響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。本研究基于木薯基因組數(shù)據(jù)庫序列，以木薯‘cv. 60444品種為材料，采用RT-PCR方法同源克隆得到MYC2基因（數(shù)據(jù)庫No. Manes.17G016000），命名為MeMYC2.1。MeMYC2.1基因開放閱讀框（ORF）全長2055 bp，無內(nèi)含子，氨基酸序列中包含典型的bHLH保守結(jié)構(gòu)域;序列比對分析發(fā)現(xiàn)MeMYC2與蓖麻MYC2具有較高同源性。外源施加植物激素水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、過氧化氫（H2O2）以及低溫脅迫下，木薯葉片中MeMYC2.1的表達(dá)被顯著誘導(dǎo)。進(jìn)一步克隆獲得MeMYC2.1基因上游1500 bp啟動(dòng)子序列，利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCare分析發(fā)現(xiàn)，MeMYC2.1啟動(dòng)子序列中不僅含有響應(yīng)茉莉酸的順式元件CGTCA/TGACG，還含有低溫響應(yīng)元件LTR及ABA響應(yīng)元件ABRE。以上研究結(jié)果表明，MeMYC2.1可能是植物激素茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）響應(yīng)低溫物脅迫分子網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)節(jié)點(diǎn)基因，對其功能的深入研究將有助于探討JAs在植物低溫脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：木薯;MeMYC2;逆境信號;茉莉酸;低溫脅迫

中圖分類號：S533? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Expression Analysis of MeMYC2 Transcription Factor in Cassava under Stress Signal

YU Xiaoling， GUO Xin， LI Shuxia， RUAN Mengbin， PENG Ming*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science / Hainan Academy of Tropical Agricultural Resource， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： MYC2 TFs is a key node member in Jasmonic acid （JA） signaling pathway， which plays an important role in plant growth， development and response to stress signals. In this study， according to the homologous similarity to AtMYC2 protein sequence， the MYC2 gene （No. Manes.17G016000） was cloned from cassava ‘cv. 60444 cultivar， named as MeMYC2.1. The characteristics of MeMYC2 protein was analyzed using bioinformatics， it encodes 2055 bp open reading frame （ORF） without introns. The N-terminal domain of MeMYC2.1 protein contain a conservative bHLH domain. According to the phylogenetic tree analysis of MYC2， the MeMYC2.1 has high homology with Ricinuscommunis. Under different abiotic stress （exogenous SA/MeJA and low-temperature （4 ℃）/H2O2）， the expression pattern of MeMYC2.1 in leaf was analyzed using qRT-PCR. The results showed that the expression of MeMYC2.1was significantlyinduced in leaves under exogenous MeJA/SA/Cold/H2O2 stress. A 1500 bp sequence located in MeMYC2.1 promoter was obtained. PlantCare analysis indicates that MeMYC2.1 promoter sequence contains not only CGTCA/TGACG elements in response to Jasmonic acid but also some stress-defense related elements like LTR， ABRE et al cis-elements. Together， these results indicate that MeMYC2.1 might be a node gene in the molecular interactive network of different phytohormone response to abiotic stress， which contributes to understanding plant resisting abiotic stress through JAs signaling pathway.

Keywords： cassava; MeMYC2; stress signals; JA; low-temperature stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.003

起源于南美洲的木薯（Manihot esculenta Cra ntz）是熱區(qū)（尤其非洲地區(qū)）主要的塊根糧食作物，生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出明顯的抗旱、耐貧瘠、對低溫敏感的特性。低溫條件下木薯發(fā)育遲緩、毒性物質(zhì)累積，其品質(zhì)、產(chǎn)量受到很大的影響[1]。增強(qiáng)木薯對低溫的耐受性，對木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用。

目前國內(nèi)外對木薯低溫響應(yīng)的研究主要集中在低溫下游功能基因的表達(dá)對植株耐低溫的影響，如苯丙胺代謝途徑關(guān)鍵基因（苯丙胺酸解氨酶PAL）的克隆與分析[1];SAD硬酯酞脫-ACP脫飽和酶促進(jìn)膜脂不飽和脂肪酸的含量[2];ROS清除相關(guān)MeCu/ZnSOD和MeCAT1過表達(dá)株系對低溫表現(xiàn)為顯著的耐受性[3]。另外，轉(zhuǎn)錄因子對木薯生長發(fā)育的影響方面已有一定的研究，如轉(zhuǎn)錄因子CBF在木薯中過表達(dá)，可增強(qiáng)木薯對低溫的耐受[4];植物特異bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員[Teosinte Branched/Cycloidea/PCF（TCP）]在擬南芥中過表達(dá)，可誘導(dǎo)ROS途徑相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對低溫的耐受[5];干擾木薯MYB2的表達(dá)也可提高木薯轉(zhuǎn)基因植株對低溫的耐受[6]。

植物激素在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中起著重要的作用[7]，參與冷脅迫的激素主要包括脫落酸（absc isic acid，ABA）、乙烯（ethylene，ETH）、茉莉酸類物質(zhì)（jasmonate，JAs）、赤霉素（gibberellins，GAs）等。茉莉酸（jasmonic acid，JA）與茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）等衍生物統(tǒng)稱為JAs，是植物激素中的重要成員?，F(xiàn)研究表明JAs不僅廣泛參與光合作用、各組織器官的發(fā)育[8]、調(diào)控植物的生長發(fā)育，同時(shí)作為脂肪酸衍生物的MeJA可作為內(nèi)源信號分子調(diào)節(jié)植物防御外來侵害，對干旱[9]、高鹽[10]等環(huán)境脅迫也有重要作用。由于MeJA能夠抑制膜脂組分的變化，降低膜透性[11]，生產(chǎn)中，人們用MeJA做保鮮劑和冷害保護(hù)劑，在西紅柿[12]、黃瓜[13]、水蜜桃[14-15]、檸檬[16]、石榴[17]等作物中已得到應(yīng)用。同時(shí)，JAs可以通過與其他激素如ABA、水楊酸（salicylic acid，SA）等或轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）間的互作完成發(fā)育過程的調(diào)控，而其中多涉及MYC2轉(zhuǎn)錄因子[18]。

木薯受低溫脅迫過程中茉莉酸發(fā)揮著怎樣的作用，目前尚無詳細(xì)報(bào)道。本研究通過克隆木薯MYC2基因，分析其在不同逆境脅迫下的表達(dá)差異，可為闡述木薯MYC2參與非生物脅迫的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本實(shí)驗(yàn)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所用植物材料為木薯‘cv. 60444。以pCAMBIA1300-35S：：GFP為基因表達(dá)載體。主要試劑：植物總RNA提取/反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根）、植物DNA提取試劑盒（天根）、DNA回收純化試劑盒（艾德萊）、平末端克隆試劑盒（天根）、熒光定量PCR反應(yīng)試劑（大連寶生物）。主要儀器設(shè)備：GEL DOC.XR凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）、DYY-4C電泳儀（北京六一）、5804R離心機(jī)（Eppendorf，美國）、Mastercyclernexus PCR儀（Eppendorf，德國）、Stepone plus熒光定量PCR儀（ABI，美國）。

1.2? 方法

木薯盆栽苗種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)大棚中，栽培基質(zhì)采用營養(yǎng)土/蛭石=1∶1（體積比）。待苗長至高1 m左右時(shí)，進(jìn)行以下脅迫處理：100 mol/L MeJA、5 mmol/L水楊酸甲酯（Salicylate，SA）、100 mol/L ABA、10 mmol/L H2O2以及冷害（4 ℃）處理1、3、6、12 h，以未經(jīng)脅迫處理的木薯植株作為對照（CK），每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。取其頂端伸展葉片，液氮速凍后?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1? MeMYC2基因的克隆? 采用天根植物RNA提取試劑盒（DP441）提取木薯葉片總RNA，利用FastKing RT kit（KR116）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA?；跀M南芥MYC2基因序列特征，通過在木薯基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phy to z o me.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show=BL A ST）搜索MYC2同源基因。利用TaKaRa高保真酶（R045），以木薯DNA/cDNA為模板，以特異性引物PCR克隆木薯MeMYC2基因序列。PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收純化、與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5;經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定為陽性克隆的送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所用引物及其序列見表1，下劃線表示酶切位點(diǎn)。

1.2.2? MeMYC2基因生物信息學(xué)分析? 利用生物信息學(xué)在線分析軟件ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam）預(yù)測MeMYC2.1蛋白理化性質(zhì)，TMHMM 2.0 Server（http：//www.-cbs.dtu.dk/ser vices/TMHMM）預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測蛋白的信號肽，Plant-mPLoc軟件預(yù)測其亞細(xì)胞定位;NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域，Swiss- Model在線分析軟件（https：//www.swissmodel. expasy.org/interactive/d697dL/models/）預(yù)測三級結(jié)構(gòu);采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建不同物種MYC2蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3? MeMYC2基因表達(dá)譜分析? 分別提取不同處理下木薯葉片RNA，進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以稀釋20倍的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。以木薯看家基因Actin為內(nèi)參基因，對木薯MeMYC2.1進(jìn)行相對表達(dá)量分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。定量PCR試劑采用TB Green Premix Ex TaqTM （TliRNaseH Plus，TaKaRa-RR820A），利用ABI stepone plus定量PCR儀完成實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析采用2CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.4? MeMYC2基因啟動(dòng)子的克隆與分析? 以天根DNA提取試劑盒（DP305）獲得木薯DNA。利用TaKaRa高保真酶（R045），以DNA為模板克隆木薯MeMYC2.1基因上游啟動(dòng)子序列，通過凝膠回收純化、與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α;經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定為陽性克隆的送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所用引物及其序列如表1所示。采用在線數(shù)據(jù)庫（http：//bioin formatics， psb.ugent.be/webtools/pla n tc are）對獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 目標(biāo)基因的選擇

通過搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲得12個(gè)木薯MYC2相似基因，經(jīng)過Blast數(shù)據(jù)比對，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)查閱，篩選出蓖麻（29827.m002528， Ricinus communis L.）、擬南芥（AT1G32640，Arabidopsis thaliana）、玉米（Zm00008a034941_T01，Zea mays）、水稻（LOC_Os10g42430，Oryza sativa）的MYC2基因序列，利用MEGA 7.0軟件，結(jié)合Neighbor-Joining計(jì)算方法（Bootstrap值設(shè)置為1000），構(gòu)建MeMYC2與其他物種（擬南芥、水稻、蓖麻、玉米）系統(tǒng)進(jìn)化樹。比對結(jié)果顯示（圖1），Manes.17G016000（命名為MeMYC2.1）和Manes.15G182700（命名為MeMYC2.2）與已報(bào)道的MYC2同源性最高;木薯MYC2與蓖麻MYC2的親緣關(guān)系最近，其次是雙子葉擬南芥，與單子葉植物水稻、玉米MYC2親緣關(guān)系稍遠(yuǎn);其他木薯MYC基因親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。本研究選擇MeMYC2.1作為目標(biāo)基因進(jìn)行研究。

2.2? MeMYC2.1克隆及序列分析

采用同位克隆的方法，根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫中Manes.17G016000.1核酸序列，以木薯葉片基因組DNA及cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異引物PCR擴(kuò)增，獲得一個(gè)具有2055 bp開放閱讀框，684個(gè)氨基酸的序列（圖2、圖3B）?；蚪MDNA及cDNA來源的序列完全一致，證明該基因序列僅含有1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子，將其命名為MeMYC2.1。

采用在線軟件ProtParam理化性質(zhì)預(yù)測MeMYC2.1蛋白質(zhì)的分子量為75 043.89 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為5.49，該蛋白因不包括任何Trp，這可能導(dǎo)致消光系數(shù)超過10%的計(jì)算誤差;氨基酸N末端為A（Ala），估計(jì)其半衰期為4.4 h，不穩(wěn)定指數(shù)為37.06，歸類為穩(wěn)定性蛋白;脂肪系數(shù)28.93，親水系數(shù)為0.755。用Plant-mPLoc軟件預(yù)測其亞細(xì)胞定位表明，該蛋白定位于細(xì)胞核;TMHMM 2.0 Server軟件預(yù)測MeMYC2.1蛋白無跨膜區(qū)，為非膜蛋白;通過SignalP（http：// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線查找信號肽，結(jié)果表明MYC2.1不存在信號肽序列，為非分泌蛋白。

利用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守功能結(jié)構(gòu)域（圖3A）預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白含有bHLH-MYC保守結(jié)構(gòu)域（N69～250），及HLH DNA結(jié)合域（N505～556），表明克隆得到的基因?yàn)槟臼鞰eMYC基因。利用在線軟件SOPMA分析蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示MeMYC2.1蛋白結(jié)構(gòu)中α-螺旋占31.73%，延伸鏈占11.84%，β-轉(zhuǎn)角占1.46%，無規(guī)則卷曲占54.97%。通過SWIS-MODEL在線軟件對MeMYC2.1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析（圖3C），其N端主要由α-螺旋和β-折疊構(gòu)成;C端主要由α-螺旋構(gòu)成。預(yù)測N端5-243片段，為MYC3晶體結(jié)構(gòu)，可與JAZ9結(jié)合位點(diǎn)（218～ 239 aa）;C端α-螺旋PDB預(yù)測可能是MYC2轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)。此結(jié)果佐證了MeMYC2.1具有的典型HLH結(jié)構(gòu)域，通過與JAZ互作參與JA信號途徑。

2.3? 不同脅迫條件下MeMYC2.1表達(dá)模式分析

qRT-PCR結(jié)果顯示：受外施MeJA誘導(dǎo)，MeMYC2.1基因表達(dá)顯著上調(diào)（圖4A），在外施MeJA 1 h時(shí)，MeMYC2.1的表達(dá)量約為處理前（CK）40倍;H2O2（圖4C）及冷害（4 ℃，圖4D）脅迫時(shí)，MeMYC2.1基因受誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。這說明木薯在JA信號通路上對低溫敏感。總體來說，低溫脅迫增強(qiáng)了JA信號途徑中節(jié)點(diǎn)基因MYC2的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)JA參與抗低溫生理效應(yīng)。MeMYC2.1的表達(dá)也受外施SA（圖4B）誘導(dǎo)，且呈逐漸增強(qiáng)趨勢，到處理6 h時(shí)到達(dá)最高峰（約為處理前的25倍），隨后回落。

2.4? MYC2.1啟動(dòng)子分析

獲得MeMYC2.1基因5端1500 bp啟動(dòng)子區(qū)域，采用Plantcare在線軟件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖5），MeMYC2.1基因啟動(dòng)子具有豐富的常見順式作用元件，如TATA-box和CAAT-box，還具有與非生物脅迫逆境相關(guān)響應(yīng)元件，如2個(gè)JA相關(guān)CGTCA、TGACG順式元件，2個(gè)低溫相關(guān)LTR元件，以及ABA應(yīng)答元件ABRE和抗性元件W-box。預(yù)示著MeMYC2.1基因可能參與多重信號調(diào)控系統(tǒng)。

3? 討論

植物在應(yīng)對低溫等環(huán)境脅迫時(shí)，JA信號途徑

發(fā)揮著重要作用。目前對擬南芥JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究較為清晰，認(rèn)為COI1-JAZ-MYC2復(fù)合體是其信號傳導(dǎo)途徑的核心元件[19]。正常情況下JAZ（Jasmonate ZIM-domain）阻遏蛋白與MYC2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻遏了MYC2下游基因的轉(zhuǎn)錄;當(dāng)植物接收外界刺激信號后，細(xì)胞內(nèi)JA累積，與異亮氨酸形成JA-Ile結(jié)合物，激活SCFCOI1（Skpl/ Cullin1/F-box protein）受體，使COI1與JAZ阻遏蛋白結(jié)合，并將JAZ泛素化進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，從而釋放MYC2，啟動(dòng)JA信號途徑下游基因的轉(zhuǎn)錄[19-22]。因此，在整個(gè)JA信號通路中，MYC2是JA信號傳導(dǎo)途徑的核心調(diào)控元件。近年來，在擬南芥、番茄、煙草、長春花、丹參等多種植物中對MYC2基因進(jìn)行了研究[23]，在植物應(yīng)答逆境刺激時(shí)起重要調(diào)控作用。

MYC2轉(zhuǎn)錄因子是bHLH家族成員之一，有bHLH保守結(jié)構(gòu)域，可與DNA結(jié)合發(fā)揮作用[18];擬南芥MYC2定位于細(xì)胞核[19]，本研究中MeMYC2.1序列具有典型bHLH類功能結(jié)構(gòu)域，蛋白三級結(jié)構(gòu)中，其C末端-螺旋PDB預(yù)測可能是MYC2轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合核定位預(yù)測結(jié)果與已有MYC2基因特征相符，推測目標(biāo)基因MeMYC2.1為MYC2基因家族成員。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MeMYC2.1與蓖麻、擬南芥等MYC2具有很高的同源性，佐證了MeMYC2.1為MYC2基因家族成員。

MeMYC2.1蛋白N末端包含MYC3晶體結(jié)構(gòu)可與JAZ9結(jié)合;且具有的典型HLH結(jié)構(gòu)域，通過與JAZ互作參與JA信號途徑。外源MeJA處理木薯葉片1 h后，MeMYC2.1的表達(dá)量即可飆升至制高點(diǎn)，因此MeMYC2.1可能是木薯JA信號途徑的早期應(yīng)答基因，這與番茄中MYC2的表達(dá)模式相符[24]。低溫脅迫（4 ℃）也可誘導(dǎo)MeMYC2.1基因的上調(diào)表達(dá)，但其表達(dá)存在滯后，隨著低溫脅迫的加深緩慢上升。另外，本研究對MeMYC2.1基因上游啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)其具有JA信號相關(guān)CGTCA、TGACG順式元件和低溫相關(guān)LTR元件。綜上所述，MeMYC2.1可能通過調(diào)控JA信號途徑參與木薯逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。MeMYC2.1受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)在冷害24 h后表達(dá)量提高顯著，這可能與低溫脅迫下木薯體內(nèi)JA的累積有關(guān)。MeMYC2.1基因具體如何參與木薯響應(yīng)低溫脅迫的過程，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究團(tuán)隊(duì)已構(gòu)建了MeMYC2.1過量表達(dá)和基因編輯載體，期望獲得MeMYC2.1轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行后續(xù)研究。

同時(shí)MYC2是茉莉酸通路與其他植物激素信號通路交互的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[25]。已有研究顯示：GA途徑DELLA阻遏物和JAZ與MYC2相互作用以抑制花中倍半萜的生物合成[26];ABA促進(jìn)其受體PYL6與MYC2的相互作用，并阻遏MYC2與靶啟動(dòng)子的結(jié)合[27];擬南芥MYC2可能在EDR1基因上游調(diào)控JA-SA的信號互作[28]。在本研究中，外施SA與MeJA皆可顯著誘導(dǎo)MeMYC2.1上調(diào)表達(dá)，因此推測，MeMYC2.1在JA/SA信號途徑中的協(xié)調(diào)作用是同向的。具體如何調(diào)控，有待后續(xù)深入研究。

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責(zé)任編輯：黃東杰