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    替普瑞酮對亞慢性苯并[a]芘染毒大鼠神經(jīng)行為改變的保護作用

    2021-06-15 08:04:34李玲常珊珊呂懿蔣勇王慧鄭金平
    關(guān)鍵詞:普瑞酮染毒海馬

    李玲,常珊珊,呂懿,蔣勇,王慧,鄭金平,2

    1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室,山西 太原 030001

    2.長治醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)系,山西 長治 046000

    苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)是最常見的環(huán)境和職業(yè)污染物之一,其在體內(nèi)的活化代謝產(chǎn)物不僅具有致癌性,對生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也具有一定毒性。由于BaP 的親脂性,其易在神經(jīng)組織集聚,可引起神經(jīng)毒作用[1]。BaP 的暴露可引起人神經(jīng)系統(tǒng)異常如認知功能障礙、學(xué)習(xí)困難、副交感神經(jīng)失調(diào)和短期記憶喪失,以及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷和行為改變[2-3]。本課題組前期流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示,BaP 職業(yè)暴露人群焦?fàn)t工人的神經(jīng)行為發(fā)生改變,主要表現(xiàn)在短期和空間學(xué)習(xí)記憶能力降低,與BaP 接觸水平之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[4]。

    替普瑞酮是一種萜烯類化合物,作為胃黏膜保護藥,臨床上主要用于治療胃潰瘍、急慢性胃炎。有研究顯示替普瑞酮可限制脊髓損傷后繼發(fā)性損傷、神經(jīng)元死亡以及進行性壞死和空化,具有神經(jīng)保護作用,是熱休克蛋白和其他神經(jīng)保護蛋白的誘導(dǎo)劑[5],但其是否可以防治BaP 誘發(fā)的神經(jīng)毒作用尚不清楚。本研究旨在觀察替普瑞酮對亞慢性BaP 染毒大鼠神經(jīng)行為的影響,探討其防治BaP神經(jīng)毒作用的可行性。

    1 對象與方法

    1.1 試劑及儀器

    橄欖油(中國成都科龍化工試劑廠),替普瑞酮(中國信陽萊耀生物科技有限公司),BaP(美國Sigma-Aldrich),Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所),Annexin V-FITC/PI 試劑盒(中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),BCA 試劑盒(中國武漢博士德生物工程有限公司),PVDF 膜、鼠抗熱休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)單克隆抗體、GAPDH 抗體及羊抗鼠二抗(美國Epitomics)。

    1.2 實驗動物與分組

    選擇健康清潔級SD 雄性大鼠40 只,體重為180~200 g,活動能力相近,由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(JIN)2015-0001。本實驗遵循動物實驗等有關(guān)規(guī)定,通過山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的審批(編號:DW2020051)。將大鼠飼養(yǎng)在自然節(jié)律采光(采光約11 h,黑暗約13 h),溫度為18~23℃,相對濕度為40%~60%,清潔安靜的環(huán)境中。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將大鼠隨機分為橄欖油溶劑對照組、替普瑞酮組、BaP染毒組和替普瑞酮+BaP染毒組,每組10只。每周稱1次大鼠體重,按800 mg·kg-1體重劑量灌胃替普瑞酮,腹腔注射6.25 mg·kg-1BaP,實驗中替普瑞酮及BaP 均由橄欖油溶解,隔日染毒,連續(xù)染毒90 d。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測采用Morris 水迷宮法檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,水迷宮實驗分為定位航行實驗(實驗前4 d)和空間探索實驗(實驗第5 d),實驗具體操作參照文獻[6]。

    1.3.2 海馬組織病理學(xué)檢查大鼠經(jīng)水迷宮行為訓(xùn)練結(jié)束后,斷頭處死,迅速分離雙側(cè)海馬,用10%中性福爾馬林溶液固定24 h后,常規(guī)脫水,透明,浸蠟,包埋制作石蠟切片(切片厚5 μm),貼附于多聚賴氨酸預(yù)處理過的載玻片上,常規(guī)HE 染色,封片,光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理學(xué)變化。

    1.3.3 TUNEL 法檢測大鼠海馬細胞凋亡大鼠經(jīng)水迷宮行為訓(xùn)練結(jié)束后,斷頭處死,迅速分離雙側(cè)海馬,石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟至水,PBS 漂洗3 遍(每次5 min);加入蛋白酶K工作液37℃反應(yīng)30 min左右,PBS漂洗3遍(每次5 min);4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS漂洗3遍(每次5 min);浸入封閉液中封閉10 min,PBS漂洗3遍(每次5 min),進行標(biāo)記反應(yīng)。

    1.3.4 Annexin V-FITC/PI法檢測大鼠海馬細胞凋亡率取大鼠海馬組織剪碎、過濾后,用預(yù)冷PBS 洗兩遍,加入不含EDTA 的胰酶消化,消化后加入預(yù)冷PBS重懸,1 000 r·min-1離心5 min(離心半徑13.5 cm),棄上清,收集細胞,預(yù)冷PBS 重懸細胞并計數(shù)。取1×105~5×105個重懸細胞,1 000 r·min-1離心5 min(離心半徑13.5 cm),棄上清,加入500 μL結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻后,加入5 μL碘化丙啶,輕輕混勻。室溫避光孵育10 min 后采用流式細胞儀進行檢測。

    1.3.5 Western blotting 法檢測Hsp70 蛋白表達水平海馬組織提取蛋白后,用BCA 試劑盒測定蛋白濃度,預(yù)冷PBS 將各組蛋白調(diào)至同一濃度,加入5×上樣緩沖液,95℃加熱20 min,1 000 r·min-1離心5 min(離心半徑13.5 cm),取上清,即得海馬組織提取蛋白。制膠(7.5%分離膠)、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜(PVDF 膜)后,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入鼠抗Hsp70 單克隆抗體(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000),4℃搖床過夜?;厥找豢?,洗膜液洗膜3 次,加入羊抗鼠二抗孵育1 h,洗膜3 次后顯影。結(jié)果用圖像處理掃描儀掃描膠片,采用捷達801 系列凝膠電泳圖像分析軟件對蛋白電泳帶的密度進行半定量分析,以Hsp70/GAPDH值表示蛋白的表達量。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)用±s表示,多組比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t法。Morris 水迷宮測試結(jié)果,經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 動物基本情況

    大鼠給藥后,替普瑞酮組與對照組大鼠均無明顯行為異常改變;BaP染毒組出現(xiàn)煩躁易驚、活動減少、進食減少、昏睡、眼屎增多;替普瑞酮+BaP 染毒組僅表現(xiàn)為活動減少,無其他明顯異常行為改變。

    2.2 動物染毒過程中體重變化情況

    各處理組大鼠實驗前對照組、替普瑞酮組、BaP 染毒組和替普瑞酮+BaP 染毒組體重分別為(188.00±4.63)、(186.14±3.42)、(183.20±9.60)、(184.16±6.26)g,各處理組體重差別無統(tǒng)計學(xué)意義。染毒結(jié)束后對照組、替普瑞酮組、BaP 染毒組和替普瑞酮+BaP 染毒組體重分別為(335.71±25.90)、(333.19±27.36)、(283.42±33.95)、(311.10± 22.38)g,替普瑞酮+BaP 染毒組體重增長大于BaP 染毒組(P<0.05)。

    2.3 大鼠Morris水迷宮結(jié)果

    如表1、2 顯示,BaP 染毒組第1~4 天尋找平臺的逃避潛伏期時間及尋找平臺總路程高于對照組、替普瑞酮組(P<0.05);BaP 染毒組尋找平臺的平均逃避潛伏期、平臺象限停滯時間和平均總路程高于對照組、替普瑞酮組(P<0.05)。替普瑞酮+BaP 染毒組第1、4 天尋找平臺的逃避潛伏期時間[(47.27±1.92)、(29.32±1.91)s]短于BaP染毒組[(63.10±1.70)、(45.71±2.04)s](P<0.05),替普瑞酮+BaP染毒組第2~4天尋找平臺總路程[(189.17±1.28)、(143.88±1.25)、(120.72±1.81)cm]高于替普瑞酮組[(124.12±1.94)、(109.11±1.34)、(89.61±1.46)cm](P<0.05)。替普瑞酮+BaP染毒組尋找平臺的平均逃避潛伏期[(29.17± 1.90)s]和平均總路程[(132.51±1.96)cm]低于BaP 染毒組[(46.77± 2.14)s、(181.97±2.09)cm](P<0.05)。

    表1 大鼠尋找平臺潛伏期和平臺象限滯留時間結(jié)果(±s,n=10)Table 1 Escape latency and quadrant retention time of rats (±s,n=10)單位(Unit):s

    表1 大鼠尋找平臺潛伏期和平臺象限滯留時間結(jié)果(±s,n=10)Table 1 Escape latency and quadrant retention time of rats (±s,n=10)單位(Unit):s

    [注]*:與對照組相比,P<0.05;&:與替普瑞酮組相比,P<0.05;#:與BaP組相比,P<0.05。

    逃避潛伏期組別平均逃避潛伏期 平均象限滯留時間第1天 第2 天 第3 天 第4 天對照組 32.36±1.86 26.92±1.82 25.70±2.00 21.38±2.40 25.12±1.95 41.49±11.44替普瑞酮組 35.41±1.76 25.91±1.61 24.48±1.58 19.98±2.01 24.31±1.76 41.65±12.14 BaP 染毒組 63.10±1.70*& 50.12±2.09*& 42.66±2.29*& 45.71±2.04*& 46.77±2.14*& 24.68±15.33*&替普瑞酮+BaP 染毒組 47.27±1.92# 43.29±1.82 38.41±1.89 29.32±1.91# 29.17±1.90# 40.72±11.31#

    表2 大鼠尋找平臺總路程結(jié)果(±s,n=10)Table 2 Total distance of rats spent on maze searching (±s,n=10)單位(Unit):cm

    表2 大鼠尋找平臺總路程結(jié)果(±s,n=10)Table 2 Total distance of rats spent on maze searching (±s,n=10)單位(Unit):cm

    [注]*:與對照組相比,P<0.05;&:與替普瑞酮組相比,P<0.05;#:與BaP組相比,P<0.05。

    組別 總路程 平均總路程第1 天 第2天 第3天 第4 天對照組 173.78±1.86 128.82±1.58 117.49±1.95 97.72±2.19 117.49±1.91替普瑞酮組 169.83±1.72 124.12±1.94 109.11±1.34 89.61±1.46 113.52±184 BaP染毒組 288.40±1.70*& 199.53±1.95*& 169.82±2.24*& 151.36±2.09*& 181.97±2.09*&替普瑞酮+BaP 染毒組 211.09±1.62 189.17±1.28& 143.88±1.25& 120.72±1.81& 132.51±1.96#

    2.4 海馬組織病理學(xué)結(jié)果

    圖1顯示,對照組、替普瑞酮組大鼠海馬區(qū)未見明顯病理改變。BaP 染毒組大鼠海馬出現(xiàn)嚴(yán)重細胞損傷,細胞結(jié)構(gòu)破壞,輪廓模糊,海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量減少、排列凌亂,出現(xiàn)明顯凋亡特征性改變,如細胞連接松解、細胞核固縮、細胞周圍出現(xiàn)環(huán)狀帶等,部分細胞出現(xiàn)壞死表現(xiàn),胞核聚集、濃縮、溶解等;而替普瑞酮+BaP 染毒組僅見個別細胞松解,海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量多于BaP染毒組,替普瑞酮+BaP染毒組比BaP染毒組損傷明顯減輕。

    圖 1 大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化 (HE染色)Figure 1 Morphological changes of rat hippocampus (HE staining)

    2.5 大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡結(jié)果

    TUNEL 法檢測結(jié)果顯示,BaP 染毒組可誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率升高。見圖2。與對照組[(3.64±2.86)%]相比,替普瑞酮組[(5.41±0.58)%]、替普瑞酮+BaP 染毒組[(11.63±2.58)%]大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率無明顯差異(P>0.05),替普瑞酮組及替普瑞酮+BaP 染毒組海馬細胞凋亡率低于BaP 染毒組[(31.11±5.54)%](P<0.001)。

    流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,與對照組[(0.27±0.12)%]相比,替普瑞酮組[(0.40±0.28)%]大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率無明顯差異,BaP染毒組[(53.10±7.34)%]海馬神經(jīng)細胞的凋亡率升高,替普瑞酮+BaP 染毒組海馬細胞凋亡率[(7.73±5.16)%]低于BaP 染毒組。BaP 染毒組海馬神經(jīng)細胞凋亡率高于對照組、替普瑞酮組(P<0.05)。

    2.6 大鼠海馬組織Hsp70蛋白表達

    圖3顯示,替普瑞酮+BaP 染毒組Hsp70 蛋白表達水平(0.89±0.09)高于BaP 染毒組(0.49±0.10),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BaP 染毒組大鼠海馬組織Hsp70 蛋白表達水平最低,且與對照組(1.07±0.30)、替普瑞酮組(1.12±0.28)相比有明顯差異(P<0.05)。

    圖 2 大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡Figure 2 Apoptosis of rat hippocampal neurons

    圖 3 大鼠海馬組織Hsp70 蛋白表達Figure 3 Hsp70 protein expression in rat hippocampus

    3 討論

    BaP 作為一種常見環(huán)境污染物,具有明顯的神經(jīng)毒性,可導(dǎo)致神經(jīng)行為和認知功能障礙,長期暴露于BaP 的大鼠和人表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)困難和記憶障礙。亞慢性BaP 暴露同樣可以導(dǎo)致大鼠行為學(xué)改變。大鼠早期暴露于BaP 會導(dǎo)致持續(xù)性的神經(jīng)損傷,并持續(xù)到青春期和成年期[7]。經(jīng)母乳攝入BaP 可引起子代大鼠發(fā)育早期運動能力及記憶認知功能的下降[8]。本次研究結(jié)果顯示,大鼠經(jīng)BaP 染毒后出現(xiàn)煩躁、易激惹、活動減少、昏睡、眼屎增多、進食減少、體重明顯降低等現(xiàn)象。Morris 水迷宮結(jié)果顯示,BaP 染毒組有明顯的神經(jīng)行為改變。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,BaP 染毒大鼠海馬出現(xiàn)嚴(yán)重細胞損傷。此外,BaP 染毒組海馬細胞的凋亡率明顯升高。表明BaP 染毒可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為改變和神經(jīng)組織損傷。

    替普瑞酮是一種萜烯類化合物,因其具有組織修復(fù)和較強的抗?jié)冏饔枚恢庇糜谥委熛罎儭D壳把芯空J為替普瑞酮是一種有效的、低毒副作用的熱休克蛋白和其他神經(jīng)保護蛋白的誘導(dǎo)劑,可在多種器官、組織中發(fā)揮保護作用[5]。單次口服替普瑞酮后,大鼠腦星形膠質(zhì)細胞激活并可減輕大鼠海馬區(qū)由海藻酸引起對的癲癇發(fā)作和神經(jīng)元細胞死亡[9-10],發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示,替普瑞酮組和對照組大鼠相比,行為無明顯變化,替普瑞酮+BaP 染毒組只見輕微的行為異常改變。替普瑞酮+BaP 染毒組大鼠尋找平臺的平均逃避潛伏期、平均總路程明顯低于BaP 染毒組,且該組大鼠神經(jīng)行為損傷并不明顯。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,替普瑞酮+BaP染毒組較BaP 染毒組細胞損傷減輕,僅有部分出現(xiàn)細胞核固縮,細胞周圍出現(xiàn)環(huán)狀帶。而且BaP 染毒大鼠經(jīng)替普瑞酮處理后海馬細胞凋亡率明顯低于BaP 染毒組。以上結(jié)果表明,替普瑞酮可以拮抗BaP引起的神經(jīng)毒性。

    Hsp70可經(jīng)多種刺激誘導(dǎo)大量生成,其可以通過發(fā)揮分子伴侶作用、抗細胞凋亡及抗氧化作用提高細胞的應(yīng)激能力,對各類損傷具有抵抗能力。而且Hsp70在應(yīng)激和非應(yīng)激情況下均能在腦組織中表達,當(dāng)腦組織應(yīng)激損傷時,能發(fā)揮其保護作用。同時,以往的研究中發(fā)現(xiàn)替普瑞酮可以誘導(dǎo)大鼠胃黏膜、肝臟、心臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Hsp70的表達,而目前的研究認為替普瑞酮是Hsp70 有效的誘導(dǎo)劑。在此基礎(chǔ)上,進一步測定了Hsp70 蛋白的表達水平,發(fā)現(xiàn)BaP可導(dǎo)致Hsp70的表達水平顯著下調(diào),而替普瑞酮+BaP染毒組可明顯提升Hsp70 表達水平。Hsp70 具有抗氧化和抗凋亡的作用,Hsp70基因遺傳多態(tài)性與神經(jīng)毒性及其他多種疾病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)焦?fàn)t工人的Hsp70-1 CC和Hsp70-2 AA基因型可能增加注意力、學(xué)習(xí)和記憶等的神經(jīng)行為損傷的風(fēng)險[11]。而Hsp70的激活又可通過促進聚谷氨酰胺蛋白降解來降低神經(jīng)毒性[12]。同時BaP染毒引起的神經(jīng)毒性中Hsp70表達減少可能與線粒體凋亡途徑的激活有關(guān),可以引起細胞凋亡。研究表明,口服替普瑞酮的大鼠可抵抗熱應(yīng)激,其作用與誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白成正比,此外,Hsp70 還與替普瑞酮的抗胃黏膜凋亡作用有關(guān)[13-14]。BaP染毒大鼠經(jīng)替普瑞酮處理后Hsp70蛋白表達上調(diào),也減少了細胞凋亡,減輕了神經(jīng)元的損害,增加神經(jīng)元的存活,改善因BaP染毒引起的神經(jīng)行為改變。因此推測,替普瑞酮可能通過提升Hsp70表達,減少細胞凋亡,從而改善BaP神經(jīng)毒性。

    綜上,替普瑞酮可以改善經(jīng)BaP 暴露引起的神經(jīng)行為改變,上調(diào)Hsp70 蛋白表達,減少細胞凋亡,減輕神經(jīng)元的損害,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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