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    腸道菌群失調(diào)對甲基汞染毒小鼠組織汞及糞汞含量的影響

    2021-06-15 08:04:34黃紅茜李鳳敏張愛華韓雪
    關(guān)鍵詞:甲基汞菌群失調(diào)盲腸

    黃紅茜,李鳳敏,張愛華,b,韓雪

    貴州醫(yī)科大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院 b.環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025

    甲基汞是汞的甲基化產(chǎn)物,是一種具有神經(jīng)毒性的環(huán)境污染物。環(huán)境中任何形式的汞(金屬汞、無機(jī)汞等)均可在一定條件下轉(zhuǎn)化為甲基汞,并在動植物體內(nèi)蓄積[1],攝入含甲基汞的食物是普通人群甲基汞暴露的主要途徑[2-3]。甲基汞主要經(jīng)由腸道吸收,約超過90%的甲基汞經(jīng)腸道吸收后分布于全身各處[4]。

    人體腸道中存在600多種、約1013~1014個微生物,從輔助消化食物、提供特定營養(yǎng)物質(zhì),到占據(jù)消化道表層、抵御病原體入侵,再到參與對免疫系統(tǒng)的訓(xùn)練等,腸道菌群在調(diào)節(jié)和維持正常的身體機(jī)能方面有著不可或缺的作用[5-6]。已有研究證實,腸道菌群是調(diào)節(jié)外源化學(xué)物(如藥物、重金屬等)生物利用度和毒性的重要因子[7-8]。

    甲基汞主要經(jīng)口暴露,在人體內(nèi)需經(jīng)過廣泛的肝腸循環(huán)過程,其半衰期約為70 d,因此甲基汞與腸道菌群之間有著“親密而持久”的接觸,但腸道微生物在甲基汞轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化中的具體作用及機(jī)制尚未明晰。本研究通過構(gòu)建抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂動物模型,探討腸道微生物在甲基汞吸收、分布、排泄中的作用,為甲基汞中毒的防治研究提供思路和資料。

    1 對象與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    主要試劑:萬古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑、氨芐青霉素(上海源葉,中國),糞便DNA 提取試劑盒(QIAGEN,德國),TRIzol 試劑(Invitrogen,美國),甲基氯化汞(Sigma,美國),熒光標(biāo)記的右旋糖酐(Sigma,美國)。

    主要儀器:3020-426 多功能全波長酶標(biāo)儀(Thermo,美國),實時熒光定量PCR 儀(Eppendorf,美國),PHSJ-4F 精密pH 計(上海精科儀器廠,中國),AFS-8520 原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司,中國),高壓密閉消解罐 (東臺市中凱亞科技有限公司,中國)。

    1.2 實驗動物和暴露方法

    1.2.1 實驗動物及分組20 只7 周齡SPF 級健康雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[合格證號:SCXK(遼)2015-0001],飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心,12 h 亮/暗循環(huán),自由攝水?dāng)z食,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后將小鼠隨機(jī)分為4 組(每組5 只):空白組、菌群失調(diào)組(單獨抗生素干預(yù)組)、甲基汞組、菌群失調(diào)+甲基汞組。本動物實驗遵循貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會規(guī)定(編號:No.1900249)。

    1.2.2 腸道菌群紊亂模型構(gòu)建及甲基汞染毒方案參照文獻(xiàn)[9-10],使用四聯(lián)抗生素構(gòu)建腸道菌群紊亂模型,四聯(lián)抗生素混合液含萬古霉素100 mg·kg-1(以體重計,后同)、硫酸新霉素200 mg·kg-1、甲硝唑200 mg·kg-1、氨芐青霉素200 mg·kg-1。BALB/c 小鼠經(jīng)四聯(lián)抗生素混合液處理4 d,1 次·d-1,灌胃量10 mL·kg-1??股亟o藥完畢后無菌收集小鼠糞便,提取糞便微生物DNA,通過PCR 驗證細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)基因水平[11],設(shè)空白管為陰性對照。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)基因水平判斷建模是否成功,抗生素干擾后小鼠糞便DNA無法擴(kuò)增出信號,則可表明大多數(shù)腸道細(xì)菌已被清除,菌群紊亂模型建立成功,造模成功后給予甲基汞染毒3 d(0.5 mg·kg-1,1 次·d-1,灌胃量10 mL·kg-1)。

    1.3 主要實驗指標(biāo)

    1.3.1 體重與臟器系數(shù)稱量并記錄小鼠染毒前及終末期體重。終末取血結(jié)束后,頸椎脫臼處死小鼠并立即進(jìn)行解剖,稱量小鼠肝臟、腎臟、腦及整段盲腸,計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器濕重(mg)/總體重(g)。

    1.3.2 汞含量檢測甲基汞組和菌群失調(diào)+甲基汞組進(jìn)行甲基汞染毒3 d,每天固定時間點灌胃。第一次甲基汞染毒后24、48、72 h 收集各組糞便,檢測糞便總汞含量;染毒結(jié)束采用5%水合氯醛麻醉小鼠,眼球取血,處死小鼠后收集肝臟、腎臟、腦、盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物樣本,液氮瓶中速凍,-80℃冰箱冷凍保存。參考GB 5009.17―2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測定》中總汞的測定方法,采用壓力罐消解對樣本進(jìn)行預(yù)處理,原子熒光光譜分析法檢測糞便、血液、肝臟、腎臟及腦組織中總汞含量。方法檢出限為0.003 mg·kg-1,加標(biāo)回收率為83%~117%。

    1.3.3 盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物pH 的檢測實驗結(jié)束,處死小鼠后收集小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物,稱取盲腸內(nèi)容物60 mg,按1 mg 盲腸內(nèi)容物添加7 μL 預(yù)冷的去離子水配置混合液,利用組織研磨儀勻漿(45 Hz,150 s),在4°C、3 500×g的條件下離心10 min,取上清于新的EP管中,重復(fù)提取一次,將兩次提取液合并后用pH計檢測pH值。

    1.3.4 腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定回腸組織,常規(guī)脫水,石蠟包埋,組織切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE染色),光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化。

    1.3.5 腸道緊密連接蛋白mRNA 水平檢測提取腸組織RNA鑒定其純度及完整性,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測腸道緊密連接蛋白Zo-1、Claudin-1、Occludin基因mRNA 的水平。引物序列見表1。

    表1 腸道緊密連接蛋白基因RT-PCR反應(yīng)引物Table 1 Primers for RT-PCR of intestinal tight junction protein genes

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD或Games-Howell檢驗法??偣勘容^用獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 腸道菌群失調(diào)模型造模結(jié)果

    空白組和甲基汞組都未給予抗生素處理,默認(rèn)空白組和甲基汞組腸道菌群的狀態(tài)一致,因此,選擇空白組為對照。如圖1,空白組小鼠糞便微生物DNA 含量為(51.07±31.65)μg·g-1,抗生素處理小鼠糞便未檢測到明顯DNA 含量。紫外光下細(xì)菌16S rRNA 通用引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,空白組小鼠具有良好的16S rRNA基因信號,抗生素處理的小鼠未檢測到明顯信號,表明抗生素處理清除了小鼠腸道內(nèi)的細(xì)菌,即腸道菌群失調(diào)建模成功。

    圖1 小鼠16s rRNA V4通用引物PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Figure1 The gel electrophoresis diagram of the PCR product of 16s rRNA V4 of mice using universal primers

    2.2 臟器系數(shù)

    各組小鼠肝臟、盲腸臟器系數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F肝=9.901,P=0.001;F盲腸=14.529,P<0.001),腦及腎臟臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白組相比,菌群失調(diào)組肝臟臟器系數(shù)下降(P<0.05),盲腸臟器系數(shù)升高(P<0.05);與甲基汞組相比,菌群失調(diào)+甲基汞組肝臟臟器系數(shù)下降(P<0.05),盲腸臟器系數(shù)升高(P<0.05)。見表2。

    表2 小鼠腦、肝、腎、盲腸的臟器系數(shù)(mg·g-1,±s,n=5)Table 2 Organ coefficients of brain,liver,kidney,and cecum of mice(mg·g-1,±s,n=5)

    [注]a:與空白組比較,P<0.05;b:與甲基汞組比較,P<0.05。

    盲腸臟器系數(shù)空白組 21.64±0.83 44.15±2.85 11.28±0.98 16.03±5.57甲基汞組 22.35±0.26 45.62±3.09 11.28±0.80 15.04±4.45菌群失調(diào)組 22.90±0.25 39.29±0.95a 11.12±0.86 33.31±8.21a菌群失調(diào)+甲基汞組 23.25±2.77 39.09±2.03b 11.67±0.54 32.78±4.76b分組 腦臟器系數(shù)肝臟臟器系數(shù)腎臟臟器系數(shù)

    2.3 血及糞便總汞含量

    隨著甲基汞的暴露時間延長,小鼠糞汞的排泄量增加。第一次甲基汞暴露后24、48、72 h,甲基汞組的糞汞含量分別為(259.87±90.94)、(616.83±197.90)、(1 322.50±377.77)ng·g-1;菌群失調(diào)+甲基汞組分別為(90.39±27.56)、(366.75±81.82)、(641.33±354.24)ng·g-1。與甲基汞組相比,菌群失調(diào)+甲基汞組小鼠糞便總汞含量降低(t24h=3.650,P=0.011;t48h=2.828,P=0.022;t72h=3.015,P=0.024)。菌群失調(diào)+甲基汞組與甲基汞組血汞含量分別為(40 290.00±5 515.11)、(28 392.00±5 813.25)ng·g-1,血汞含量升高(t=-2.623,P=0.031);空白組及菌群失調(diào)組總汞含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義,詳見圖2。

    圖2 甲基汞暴露期間小鼠糞便總汞(A)和血液總汞(B)含量(n=5)Figure 2 Total mercury level in feces (A) and blood (B) of mice during methylmercury exposure (n=5)

    2.4 肝、腎、腦總汞含量

    甲基汞組肝、腎、腦總汞含量分別為(2752.86±566.09)、(4 502.08±105.76)、(827.54±106.50)ng·g-1,菌群失調(diào)+甲基汞組分別為(4 090.38±929.44)、(8 539.97±1 242.64)、(1 348.24±336.69)ng·g-1。與甲基汞組相比,菌群失調(diào)+甲基汞組小鼠肝、腎、腦總汞含量均升高(t肝=-2.748,P=0.025;t腎=-6.476,P=0.001;t腦=-3.297,P=0.011)??瞻捉M及菌群失調(diào)組總汞含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.5 盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH

    各組小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH 值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F盲腸=11.295,P<0.001,F(xiàn)結(jié)腸=54.081,P<0.001)。與空白組相比,菌群失調(diào)組盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值升高(均P<0.05);與甲基汞組相比,菌群失調(diào)+甲基汞組盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值升高(均P<0.05)。見表3。

    表3 小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值(±s,n=5)Table 3 pH values of cecum and colon of mice (±s,n=5)

    表3 小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值(±s,n=5)Table 3 pH values of cecum and colon of mice (±s,n=5)

    [注]a:與空白組比較,P<0.05;b:與甲基汞組比較,P<0.05。

    分組 盲腸 結(jié)腸空白組 7.98±0.06 7.49±0.10甲基汞組 7.94±0.14 7.47±0.06菌群失調(diào)組 8.24±0.04a 7.95±0.07a菌群失調(diào)+甲基汞組 8.08±0.11bb 8.11±0.13b

    2.6 腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察

    如圖3所示,空白組回腸組織結(jié)構(gòu)完整,腸絨毛較長且較為整齊,腸絨毛被覆單層柱狀上皮,黏膜下層、肌層和外膜連接緊密,未見明顯病理變化;菌群失調(diào)組腸絨毛壞死溶解,上皮細(xì)胞脫落,固有層輕微水腫等改變。

    圖3 各組小鼠腸組織病理學(xué)變化(HE染色)Figure 3 Pathological changes of intestine of mice in each group (HE staining)

    2.7 腸道緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)

    各組小鼠腸組織腸道緊密連接蛋白mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FOccludin=8.855,P=0.006;FZo-1=7.748,P=0.009;FClaudin-1=13.753,P=0.002)。與空白組相比,菌群失調(diào)組腸組織Occludin、Zo-1、Claudin-1mRNA 表達(dá)水平下降(均P<0.05);與甲基汞組相比,菌群失調(diào)+甲基汞組腸組織Occludin、Zo-1、Claudin-1mRNA表達(dá)水平下降(均P<0.05)。見圖4。

    圖4 小鼠Claudin-1(A)、Occludin(B)和Zo-1(C) mRNA表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of Claudin-1 (A),Occludin (B),and Zo-1 (C) mRNA of mice

    3 討論

    作為接觸外源化學(xué)物的第一批“細(xì)胞”,腸道某些益生菌可與外源化學(xué)物螯合使其隨著菌株通過糞便排泄,或?qū)⑼庠椿瘜W(xué)物進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化,改變其溶解性進(jìn)而將其清除。甲基汞向無機(jī)汞的生物轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是甲基汞消除的必要中間步驟,來自甲基汞的“汞”轉(zhuǎn)化為不易吸收的無機(jī)汞后主要經(jīng)糞便排泄。Caito等[12]觀察到人類在服用抗生素后,體內(nèi)甲基汞的消除速度明顯降低。Bisanz 等[13]則發(fā)現(xiàn)與對照組相比,每天食用益生菌(即酸奶)的坦桑尼亞孕婦血汞濃度顯著降低。Jadán-Piedra 等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)益生菌即嗜酸乳桿菌BL17 和干酪乳桿菌BL23 可促進(jìn)甲基汞暴露小鼠糞汞的排出,減少體內(nèi)汞水平。與以往研究相似,在本研究中,相對于正常小鼠,菌群紊亂小鼠體內(nèi)血、肝、腎、腦組織的汞含量升高,而排出的糞汞含量降低,提示腸道菌群可能是甲基汞代謝和汞循環(huán)的重要參與者。

    腸黏膜屏障由腸道上皮細(xì)胞連接復(fù)合體及其分泌物、腸相關(guān)免疫細(xì)胞及腸內(nèi)正常菌群組成,主要包括生物屏障、化學(xué)屏障、機(jī)械屏障和免疫屏障。腸黏膜屏障作為控制有毒化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體的第一道防線,能限制腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如毒素或細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和體內(nèi)其他組織器官,其完整性依賴于微生物與宿主的相互作用。腸道微生物可通過影響腸道上皮通透性和緊密連接,調(diào)控腸道上皮細(xì)胞凋亡等多種作用影響腸道機(jī)械屏障。體外研究結(jié)果顯示,腸道菌群可通過改善腸道機(jī)械屏障功能阻止腸上皮細(xì)胞對糞便中濃縮甲基汞的再吸收[14]。緊密連接蛋白Zo-1、Occludin表達(dá)量及分布的變化可以代表腸屏障功能的變化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)相對于空白組,菌群紊亂小鼠的腸道出現(xiàn)了腸絨毛壞死溶解、上皮細(xì)胞脫落等病理改變;同時,菌群紊亂小鼠的緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、Zo-1mRNA表達(dá)水平下降,提示腸黏膜機(jī)械屏障可能受損,通過增加腸道通透性可使甲基汞更易通過腸屏障或直接從腸細(xì)胞間滲漏,增加甲基汞的吸收。

    腸道微生物除構(gòu)成腸道的生物屏障外,還可通過促進(jìn)黏液的分泌和產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物影響腸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)腸道化學(xué)屏障[16]。腸道菌群產(chǎn)生的水解酶催化底物生成的有機(jī)酸及短鏈脂肪酸可降低腸腔pH 值,而腸道pH 值則可影響金屬離子的溶解性和細(xì)胞表面基團(tuán)的電離狀態(tài),進(jìn)而干擾其轉(zhuǎn)運。本研究發(fā)現(xiàn)菌群紊亂小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值高于空白組,提示腸道菌群通過參與維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)影響甲基汞的吸收。

    盲腸是汞吸收的主要部位之一,本研究發(fā)現(xiàn)菌群紊亂小鼠盲腸的重量大約是空白組的兩倍。已有研究發(fā)現(xiàn),無菌鼠的盲腸比普通鼠大5~7 倍[17],因此推測盲腸的重量及體積受到腸道微生物的影響。盲腸內(nèi)容物的增多、變稀可使小鼠腸動力下降[18],使腸內(nèi)容物在盲腸內(nèi)的停留時間延長,從而增加小鼠體內(nèi)甲基汞的吸收,這也是本研究觀察到血汞及組織汞濃度增加的可能原因之一。

    本研究結(jié)果表明,腸道菌群直接參與或間接影響著甲基汞的吸收、分布與排泄,腸道菌群紊亂可促進(jìn)甲基汞的吸收,減少其排泄,增加其在組織中的分布。腸道菌群是一個復(fù)雜而龐大的系統(tǒng),不同的菌群在物質(zhì)轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化中扮演著不同的角色,因此,腸道菌群在甲基汞體內(nèi)動力學(xué)過程中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究與探索。

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