HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方活血膠囊中6 種成分

何澤源張妍妍林 楠李金玲馮 旭*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧530200； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530200）

近30 年來，中風(fēng)位居我國(guó)人民過早死亡疾病因素的第一位［1］。復(fù)方活血膠囊為廣西南寧宏康仁濟(jì)堂中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由赤芍、黃芪、懷牛膝、川芎、水蛭、僵蠶等15 味藥材組成，具有活血化瘀、搜風(fēng)通絡(luò)等作用，主治因中風(fēng)所致的半身不遂、口舌歪斜等癥狀，長(zhǎng)期臨床效果良好。方中赤芍功效鎮(zhèn)痛散瘀、涼血清熱［2］，所含的芍藥苷具有補(bǔ)血、抗腫瘤、抗氧化等作用［3］；黃芪功效補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表，所含的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)血管具有一定保護(hù)作用［4?5］，也是《中國(guó)藥典》規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)成分；川芎功效活血行氣、祛風(fēng)止痛，所含的阿魏酸及其衍生物具有抑制血小板聚集［6?7］、抗血栓形成［8］等作用；懷牛膝功效活血通經(jīng)、利尿通淋［9］，所含的β?蛻皮甾酮是《中國(guó)藥典》 規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)成分。目前，在復(fù)方活血膠囊原標(biāo)準(zhǔn)中只有簡(jiǎn)單的性狀鑒別，故本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定該制劑中綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮的含量，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；L600 型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；DHG?9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；UPC?11?10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥 10 批復(fù)方活血膠囊由廣西南寧宏康仁濟(jì)堂中醫(yī)院提供（批號(hào) 20190902、20190903、20190906、20190907、20170908、20190911、20190912、20190913、20190915、20190916）。綠原酸（批號(hào)5077，純度98.3%）、芍藥苷（批號(hào)5859，純度98.9%）、β?蛻皮甾酮（批號(hào)4938，純度99.6%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)5240，純度98.8%）、苯甲酸（批號(hào)5986，純度99.7%）對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)0773?9910）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?甲醇（B）?0.2%磷酸（C），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮對(duì)照品適量，甲醇溶解定容，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.070 45、0.190 1、0.016 22、0.014 50、0.041 21、0.013 58 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊20 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取2 g 粉末，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇超聲處理60 min，冷卻，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴揮干后甲醇定容至10 mL，0.2 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按制劑處方和工藝，分別制備缺赤芍、缺黃芪、缺懷牛膝、缺川芎的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分在對(duì)照品相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮峰面積RSD 分別為1.2%、0.94%、1.1%、0.55%、0.67%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)20190916），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮峰面積RSD 分別為1.8%、0.87%、1.1%、0.69%、0.77%、0.97%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6 份膠囊（批號(hào)20190916），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮含量RSD 分別為1.4%、1.6%、1.7%、1.0%、0.9%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6 份膠囊（批號(hào)20190916），每份約1.0 g，精密加入各對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率（RSD）分別為綠原酸98.74%（2.1%）、芍藥苷98.85%（1.4%）、阿魏酸100.03%（2.2%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷98.54%（1.7%）、苯甲酸99.34%（1.5%）、β?蛻皮甾酮99.24%（2.0%）。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取10 批膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 在復(fù)方活血膠囊中，赤芍、黃芪、懷牛膝補(bǔ)益氣血，為君藥；川芎活血行氣，通絡(luò)祛瘀，與君藥配伍后互相佐制，為臣藥。制定制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要以主要藥效成分為指標(biāo)［10］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合藥理作用［11?13］和2020 版《中國(guó)藥典》黃芪、懷牛膝、赤芍、川芎含量測(cè)定要求，選擇赤芍中芍藥苷、苯甲酸，黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷，懷牛膝中β?蛻皮甾酮，川芎中綠原酸、阿魏酸作為指標(biāo)，進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 供試品溶液制備方法篩選

3.2.1 提取溶劑 考察了甲醇、水、95% 乙醇，50%乙醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時(shí)各成分含量最高，提取效果最好。

3.2.2 提取方法 考察了超聲、回流、冷浸，發(fā)現(xiàn)超聲、回流提取時(shí)各成分含量較高，以前者效果更好。

3.2.3 提取時(shí)間 考察了30、60、90、120 min，發(fā)現(xiàn)提取60、90、120 min 時(shí)各成分含量較高，綜合考慮其他因素，選擇60 min。

3.2.4 料液比 考察了1 ∶10、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶50，發(fā)現(xiàn)1 ∶25 時(shí)各成分含量較高，其原因可能是隨著溶劑用量升高，各成分溶出增加，但當(dāng)其用量達(dá)到某閾值時(shí)，雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致成分溶出量反而降低。

3.3 色譜條件篩選

3.3.1 色譜柱 考察了依利特、Waters、Inerstil等不同廠家的色譜柱，發(fā)現(xiàn)Waters 公司產(chǎn)者分離效果最好，重復(fù)性最理想。

3.3.2 流動(dòng)相 由于各成分極性差異較大，等度洗脫難以達(dá)到分離要求，故采用梯度洗脫?？疾煲译?、甲醇、0.2% 磷酸不同組合，發(fā)現(xiàn)乙腈?甲醇?0.2%磷酸體系分離度良好，干擾少［14］。

3.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng) 通過HPLC?DAD 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收波長(zhǎng)分別為綠原酸330 nm、芍藥苷235 nm、阿魏酸325 nm、毛蕊異黃酮葡萄糖苷223 nm、苯甲酸235 nm、β?蛻皮甾酮251 nm，即綠原酸、阿魏酸與其他成分差別很大，轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)法效果不理想，但兩者在240 nm 波長(zhǎng)處也具有較高吸收，考慮到雜質(zhì)峰干擾及成分含量差異、峰形等，確定為240 nm。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方活血膠囊中綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苯甲酸、β?蛻皮甾酮的含量，發(fā)現(xiàn)部分批次樣品偏低，可能是藥材質(zhì)量差異所致，需加以關(guān)注。同時(shí)，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可為復(fù)方活血膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。