復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒成型工藝的優(yōu)化及質(zhì)量控制

馬 肖要林青張瑞堂張紅梅*

（1.西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730000）

月經(jīng)不調(diào)的臨床癥狀主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常［1］，若不及時(shí)治療則病情加重，直接導(dǎo)致婦女不孕［2］，西醫(yī)對(duì)其治療效果較差，而中醫(yī)從整體出發(fā)，體現(xiàn)了顯著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，月經(jīng)不調(diào)主要與氣血兩虛、濕熱下注、陰虛血熱有關(guān)，故應(yīng)選用補(bǔ)血活血、舒暢氣機(jī)的方藥進(jìn)行辨證施治［4］。

經(jīng)典名方桃紅四物湯雖具行血通淤之力，但乏補(bǔ)益元?dú)庵埽诖嘶A(chǔ)上加減具有益氣補(bǔ)血的當(dāng)歸補(bǔ)血湯時(shí)，對(duì)月經(jīng)不調(diào)的臨床療效將會(huì)大幅度提升［5?6］。甘肅省第二人民醫(yī)院吳華主任醫(yī)師通過(guò)將當(dāng)歸補(bǔ)血湯與桃紅四物湯加減而組成復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯，在益氣生血的基礎(chǔ)上兼能行血通淤，臨床應(yīng)用多年，取得了良好的效果，為了更好地使用該方，需要將其開發(fā)成醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，同時(shí)為方便患者用藥，將其劑型確定為顆粒劑。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以顆粒性狀、成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性為考察指標(biāo)，對(duì)復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒處方及輔料種類、用量進(jìn)行考察，優(yōu)化成型工藝，并進(jìn)行質(zhì)量控制研究，以期為該制劑相關(guān)開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀；SY3200?T 型超聲波清洗器（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）；BT125D 型電子天平［萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；S?430 型PH 計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；WFH?201B型紫外反射透射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；ATS?4 型自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士Camag 公司）。

1.2 試劑與藥物 阿魏酸（批號(hào) 110768?201913）、芍藥苷（批號(hào)110736?201938）對(duì)照品及當(dāng)歸（批號(hào)120945?201916）、白芍（批號(hào)120976?201909）對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇均為藥用輔料級(jí)（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；CMC?Na 為藥用輔料級(jí)（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）。水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 顆粒制備 按照前期優(yōu)選得到的提取工藝［7］制備，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱取處方藥材適量，加25 倍量水浸泡0.5 h 后提取2 次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮得稠膏，干燥得浸膏粉。將輔料按一定比例與浸膏粉混合均勻，加適量0.65% CMC?Na 作為潤(rùn)濕劑制成軟材，呈“握之成團(tuán)，觸之即散”后過(guò)12 目篩制粒，60 ℃下干燥3 h，1、5 號(hào)篩整粒，即得。

2.2 指標(biāo)檢測(cè) 以顆粒形狀、成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算公式為綜合評(píng)分＝（15／最大成型率）×成型率＋（15／最大堆密度）×堆密度＋（最小休止角×15）／休止角＋（20／最大溶化性）×溶化性＋（最小吸濕率×35）／吸濕率。

2.2.1 成型率 參考文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道。取3 份顆粒，每份約5 g，收集能通過(guò)1 號(hào)篩但不能通過(guò)4號(hào)篩者，稱定質(zhì)量，計(jì)算成型率，公式為成型率＝（過(guò)篩后顆粒質(zhì)量／過(guò)篩前顆粒質(zhì)量）×100%。

2.2.2 堆密度 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道。取3 份過(guò)篩后的顆粒，每份約5 g，稱定質(zhì)量M，放入干燥的量筒中輕輕振動(dòng)，直至體積不再下降為止，讀出其近刻度處的體積數(shù)（V），計(jì)算堆密度，公式為堆密度＝M／V。

2.2.3 休止角 參考文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道，采用固定漏斗法測(cè)定。將串聯(lián)的3 只漏斗固定于鐵架臺(tái)上，漏斗口距水平坐標(biāo)紙上方1 cm（H），將顆粒沿最上端漏斗中自上而下流到坐標(biāo)紙上，當(dāng)?shù)撞啃纬傻膱A錐體接觸到最下邊的漏斗口時(shí)停止，平行5 份，讀取圓錐體直徑（2R），計(jì)算休止角α，公式為tgα ＝H／R。

2.2.4 溶化率 參考文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道。稱取顆粒3 份，每份約0.5 g，放入3 個(gè)干燥至恒重的離心管中，加入5 mL 沸水?dāng)嚢瑁? 000 r／min 離心15 min，棄去上清液，殘?jiān)阒睾缶芊Q定質(zhì)量，計(jì)算溶化率，公式為溶化率＝（溶化顆粒質(zhì)量／顆粒質(zhì)量）×100%。

2.2.5 吸濕性 精密稱取過(guò)篩后顆粒3 份，每份約0.5 g，放入3 個(gè)干燥至恒重的稱量瓶中，稱定質(zhì)量，置于相對(duì)濕度75%的干燥器中48 h，再次稱定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率，公式為吸濕率＝［（吸濕后質(zhì)量－吸濕前質(zhì)量）／吸濕前質(zhì)量］ ×100%。

2.3 稀釋劑種類篩選 將糖粉、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇按一定比例與“2.2”項(xiàng)下浸膏粉進(jìn)行混合，加適量0.65%CMC?Na 作為黏合劑制軟材，呈“握之成團(tuán)，觸之即散”后過(guò)12 目篩制粒，在60 ℃下干燥3 h，1、5 號(hào)篩整粒，測(cè)定成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性，結(jié)果見表1～2。由此可知，糖粉所得顆粒成型率較低，并且不利于糖尿病患者用藥；可溶性淀粉所得顆粒溶化性較好，但休止角偏低，流動(dòng)性不佳，影響其質(zhì)量穩(wěn)定性；甘露醇所得顆粒性狀好，結(jié)塊少，但堆密度較小，表明其孔隙率較高；乳糖、糊精所得顆粒外觀性狀理想，綜合評(píng)分較高，故選擇兩者作為稀釋劑。

表1 稀釋劑種類對(duì)顆粒性狀的影響Tab.1 Effects of diluent type on the characters of granules

2.4 黏合劑種類篩選 本實(shí)驗(yàn)按1 ∶0.25 ∶0.25比例稱取浸膏粉、糊精、乳糖各6 份，分別以95%乙醇、0.65%CMC?Na 制軟材，過(guò)12 目篩制粒，在60 ℃下干燥3 h，1、5 號(hào)篩整粒，測(cè)定成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性，結(jié)果見表3。由此可知，以95% 乙醇為黏合劑時(shí)粗顆粒較多，成型率、堆密度、休止角得分較低，故選擇0.65%CMC?Na 作為黏合劑。

表2 不同稀釋劑綜合評(píng)分（分）Tab.2 Comprehensive scores for different diluents（score）

表3 不同黏合劑綜合評(píng)分（分，， n＝3）Tab.3 Comprehensive scores for different adhesives（score，， n＝3）

表3 不同黏合劑綜合評(píng)分（分，， n＝3）Tab.3 Comprehensive scores for different adhesives（score，， n＝3）

2.5 中心復(fù)合設(shè)計(jì)?響應(yīng)面法優(yōu)化 在輔料種類篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇糊精（A）、乳糖（B）、0.65%CMC?Na（C）用量作為影響因素，成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕性的綜合評(píng)分（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備顆粒，通過(guò)Design?Expert 軟件進(jìn)行3 因素5 水平中心組合設(shè)計(jì)，因素水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（分）Tab.5 Design and results of tests（score）

通過(guò)Design?Expert 8.05b 軟件對(duì)表6 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得方程為Y＝71.86＋0.60A－2.86B－3.44C＋9.93AB－11.11AC＋5.47BC＋1.79A2－3.85B2＋7.46C2（r＝0.954 3，P＜0.01），響應(yīng)面分析見圖1。由此可知，最優(yōu)成型工藝為浸膏粉、乳糖、糊精、0.65% CMC?Na 比例1 ∶0.35 ∶0.25 ∶0.1，綜合評(píng)分96.94 分。

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均綜合評(píng)分為95.97 分，與預(yù)測(cè)值96.94 分接近，表明輔料配比重復(fù)性理想。

2.7 TLC 定性鑒別 參考文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道。

2.7.1 當(dāng)歸 按“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備顆粒，研細(xì)，取粉末約5.0 g，精密稱定，加入2% NaHCO3溶液50 mL，超聲（250 W、40 kHz）處理60 min，抽濾，濾液加10%鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2～4，以鋪有適量硅藻土的布氏漏斗進(jìn)行抽濾，濾液用乙酸乙酯萃取2～3 次，合并乙酸乙酯層，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，制得供試品溶液；精密稱取阿魏酸對(duì)照品1 mg，加甲醇1 mL 溶解，制得1 mg／mL對(duì)照品溶液；取當(dāng)歸對(duì)照藥材粉末約4.0 g，按供試品溶液制備方法制得對(duì)照藥材溶液；原處方去除當(dāng)歸后的其余藥味制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。定量毛細(xì)管吸取上述4 種溶液各約8 μL，以甲苯?二氯甲烷?乙酸乙酯?冰乙酸（5 ∶3 ∶2 ∶1）［6?8］為展開劑展開，晾干后在365 nm 波長(zhǎng)紫外燈下檢視，結(jié)果見圖2。由此可知，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

圖2 當(dāng)歸TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Angelicae sinensis Radix

2.7.2 白芍 按“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備顆粒，研細(xì)，取粉末約7.0 g，精密稱定，加入20 mL 甲醇，室溫下振蕩提取60 min，以鋪有適量硅藻土的布氏漏斗進(jìn)行抽濾，濾液減壓濃縮至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，制得供試品溶液；精密稱取1 mg芍藥苷對(duì)照品，加1 mL 甲醇溶解，制得1 mg／mL對(duì)照品溶液；取白芍對(duì)照藥材粉末約2.0 g，按供試品溶液制備方法制得對(duì)照藥材溶液；原處方去除白芍后的其余藥味制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。定量毛細(xì)管吸取上述4種溶液各約4 μL，以乙酸乙酯?甲酸?冰乙酸?水（14 ∶1 ∶1 ∶2）［9］為展開劑展開，晾干后以現(xiàn)配的5%香草醛硫酸乙醇溶液為顯色劑顯色，結(jié)果見圖3。由此可知，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

圖3 白芍TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Paeoniae Radix Alba

2.8 HPLC?DAD 含量測(cè)定

2.8.1 色譜條件 Thermo ODS Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（含0.1%磷酸）（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10% B；5～15 min，10%～15% B；15～20 min，15%B；20～30 min，15%～25% B；30～50 min，25%～60%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm（芍藥苷）、323 nm（阿魏酸）；進(jìn)樣量10 μL。

2.8.2 供試品溶液制備 取研細(xì)的顆粒粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲（50 kHz、25 ℃）處理45 min，放冷，甲醇定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.8.3 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取阿魏酸、芍藥苷對(duì)照品0.6、2.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.06、0.2 mg／mL 的對(duì)照品溶液，保存于4 ℃冰箱中，各精密吸取2 mL，置于同一5 mL 量瓶中，即得。

2.8.4 陰性樣品溶液制備 原方去除白芍，其余藥味制成陰性樣品，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.8.5 專屬性試驗(yàn) 取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖4。由此可知，供試品、對(duì)照品溶液中芍藥苷保留時(shí)間分別為12.621、12.663 min，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

根據(jù)氨基酸序列不同，可將殼聚糖酶分為5個(gè)糖苷水解酶家族，分別為:GH-5、GH-8、GH-46、GH-75和GH-80。在這些家族中，GH-75的成員主要來(lái)自真菌和放線菌，GH-46家族來(lái)自于Bacillus和Streptomyces的殼聚糖酶，其催化特性、酶反應(yīng)機(jī)理和蛋白結(jié)構(gòu)已被廣泛研究。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.8.6 線性關(guān)系考察 精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，芍藥苷對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，定容至5 mL 量瓶中，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，平行3 次。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表6，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表6 各成分線性關(guān)系Tab.6 Linear relationships of various constituents

2.8.7 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定3 次，測(cè)得阿魏酸、芍藥苷峰面積RSD 分別為2.23%、1.56%，表明儀器精密度良好。

2.8.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取顆粒6 份，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得阿魏酸、芍藥苷含量RSD 均為1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份“2.8.2”項(xiàng)下供試品溶液，于0、3、6、12、24 h 在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得阿魏酸、芍藥苷峰面積RSD 分別為0.54%、1.43%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取顆粒9 份，隨機(jī)分為3 組，每組分別精密加入低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，阿魏酸、芍藥苷平均加樣回收率分別為100.06%、99.75%，RSD 分別為1.99%、1.59%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3 份顆粒，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.618、0.621、0.612 mg／g，平均0.617 mg／g；芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.596、8.396、8.841 mg／g，平均8.611 mg／g。

3 討論

3.1 輔料選擇 為了將復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血顆粒開發(fā)成可溶性顆粒，本實(shí)驗(yàn)在處方設(shè)計(jì)時(shí)將糖粉、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇作為稀釋劑?；诨颊咭缽男越Y(jié)合各稀釋劑綜合評(píng)分，最終選擇乳糖?糊精［13?15］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 優(yōu)化方法選擇 中心復(fù)合設(shè)計(jì)法相比正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)法采用的線性數(shù)學(xué)模型，其所用的復(fù)相關(guān)系數(shù)、實(shí)驗(yàn)精度均有較明顯的提升，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)將單因素試驗(yàn)與該方法相結(jié)合，可使設(shè)計(jì)更科學(xué)合理。

3.3 指標(biāo)成分選擇 復(fù)方當(dāng)歸補(bǔ)血湯方中藥味較多，成分復(fù)雜，藥理活性、譜?效關(guān)系、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，阿魏酸為當(dāng)歸、黃芪、川芎共有成分，補(bǔ)血作用最強(qiáng)［17］；芍藥苷是白芍主要有效成分［18］，為治療血瘀證的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［19］；藁本內(nèi)酯對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞不同形式的收縮都有舒張作用，顯示出該成分在治療婦科疾病方面的應(yīng)用［20］。預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪、紅花、桃仁等藥味的主要有效成分進(jìn)行了HPLC 分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)法進(jìn)行含量測(cè)定，制成顆粒后藁本內(nèi)酯色譜峰也消失。最終，本實(shí)驗(yàn)選擇藥理活性顯著、含量較高、可準(zhǔn)確定性的阿魏酸、芍藥苷作為指標(biāo)成分。

3.4 定性鑒別方法選擇 本實(shí)驗(yàn)選擇乙醚、乙酸乙酯作為阿魏酸萃取溶劑，發(fā)現(xiàn)經(jīng)后者萃取所得的圖譜斑點(diǎn)清晰、分離度好。為減少雜質(zhì)干擾和拖尾現(xiàn)象，再分別采用Al2O3、硅藻土對(duì)提取液進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)前者對(duì)阿魏酸、芍藥苷均有吸附作用，故采用鋪有適量硅藻土的布氏漏斗進(jìn)行抽濾作為純化方法。