芍藥苷-6′-O苯磺酸酯調(diào)節(jié)GRK2對(duì)CIA大鼠巨噬細(xì)胞JAK1/STAT3信號(hào)通路的影響

斯 夢(mèng)，張春梅，姜 玲，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性、破壞性自身免疫性疾病，以全身免疫功能異常紊亂為特征，局部表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)炎癥，大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜增生，血管翳生成，會(huì)對(duì)肌腱、軟骨和骨骼造成不可逆的損害[1]。增生的滑膜組織中存在大量浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互作用可以促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子的分泌，特別是前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)等，巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[2]。根據(jù)表型和分泌的因子，目前巨噬細(xì)胞被分為 M1 型和 M2 型巨噬細(xì)胞，正常生理情況下M1型與M2型處于動(dòng)態(tài)平衡中。M1 型巨噬細(xì)胞通常被視為是促炎型巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，M2 巨噬細(xì)胞則被視為是抗炎型巨噬細(xì)胞[3]。JAK1/STAT3信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌PGE2、IL-6等炎性因子[4]在許多免疫介導(dǎo)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而IL-6也可以激活JAK1/STAT3信號(hào)通路。G 蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein coupled receptor kinase 2,GRK2)是一種重要的炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白，GRK2的表達(dá)和活性的失衡在RA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，課題組以往研究表明，PGE2不斷刺激下，腹腔巨噬細(xì)胞中EP4受體過(guò)度脫敏, GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，與EP4受體共表達(dá)增加，cAMP 和p-CREB表達(dá)減少， PGE2-EP4-cAMP-CREB信號(hào)通路的異常介導(dǎo)CIA小鼠巨噬細(xì)胞向M1型極化，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,增強(qiáng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和破壞軟骨和骨骼[5]。芍藥苷(paeoniflorin,Pae)已普遍用于治療自身免疫性疾病，但由于Pae的滲透性較差，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能發(fā)揮作用,為了改善這一特性，將Pae酯化后，得到了具有較好的脂溶性和生物利用度的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物CP-25，CP-25在佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant induced arthritis,AA)和膠原性關(guān)節(jié)炎 (collagen-induced arthritis,CIA)大鼠和小鼠的體內(nèi)直接發(fā)揮改善炎癥的作用，已證實(shí)其主要是通過(guò)抑制CRK2轉(zhuǎn)膜，進(jìn)而影響多種信號(hào)通路[6-8]，課題組研究已發(fā)現(xiàn)CP-25可降低人外周血單核細(xì)胞p-JAK1、p-STAT3的蛋白表達(dá)[9]。然而，在巨噬細(xì)胞中GRK2與JAK1-STAT3信號(hào)的關(guān)系及CP-25的調(diào)控作用尚不清楚。本研究旨在探討在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎中，IL-6、PGE2影響下的巨噬細(xì)胞JAK1/STAT3與GRK2之間是否存在聯(lián)系，CP-25是否通過(guò)調(diào)節(jié)GRK2進(jìn)而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞JAK1/STAT3的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠34只，6周齡，(180-200) g，購(gòu)自北京維通利華有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，給予動(dòng)物自由飲水與攝食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20-25)℃，濕度40%-70%，光照12 h。

1.1.2試劑 Arthrogen-CIA II 型膠原(20011，美國(guó) chondrex 公司)； 完全弗氏佐劑(F5881,美國(guó) Sigma 公司)；DMEM培養(yǎng)液(12100046，美國(guó) HyClone 公司)；胎牛血清(16000-044，以色列Biolnd公司)；CP-25(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所)；托法替布(HY40354A，美國(guó)MCE公司)；PGE2、IL-6( 3632464、500-P73，Peprotech 生物公司)；鼠抗GRK2抗體、PE標(biāo)記的anti-rat CD206抗體(sc-13143、sc-376108，美國(guó)Santa cruz 公司)；兔抗JAK1(ab133666，英國(guó)Abcam公司)；p-JAK1、STAT3(AF2012、AF6294，美國(guó)Affinity公司)、p-STAT3抗體(9145，美國(guó)CST公司)；APC標(biāo)記的anti-rat CD68抗體、FITC標(biāo)記的anti-rat CD86抗體(130-103-364、130-109-129，德國(guó)Miltenyi 公司)；大鼠PGE2、IL-6 ELISA試劑盒(ml003036、ml064292，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 Infinite M1000 PRO 多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司)；Image Quant熒光及化學(xué)熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；Beckman CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman 公司)； ImageStreamX Mark Ⅱ成像流式細(xì)胞儀(Meck Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠CIA模型的建立及給藥分組 SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組，其余大鼠于尾根部及右后跖底部分別皮內(nèi)注射0.1 mL完全弗氏佐劑與雞Ⅱ型膠原等體積混合、乳化制成的Ⅱ型膠原乳劑，7 d后于尾根部加強(qiáng)注射1次，d 17根據(jù)大鼠繼發(fā)側(cè)足爪腫脹情況選出18只為造模成功的CIA大鼠，隨機(jī)將CIA大鼠分為模型組、CP-25(50 mg·kg-1·d-1)組、MTX(0.5 mg·kg-1·3 d-1)組。每組6只，于d 18開(kāi)始灌胃給藥。給藥共21 d，結(jié)束后處死大鼠。

1.2.2大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 處死大鼠后，向腹腔中注入15 mL生理鹽水，按摩腹部之后靜置3 min，使腹腔巨噬細(xì)胞富集，抽出細(xì)胞懸液，離心2 500 r·min-1，10 min，之后加入10% 高糖DMEM培養(yǎng)基重懸至6孔板，貼壁3 h后，棄去上清，用無(wú)菌的PBS洗滌3遍，貼壁的為純化后的巨噬細(xì)胞，加入10% 高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3大鼠整體指標(biāo)、胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定 每3 d評(píng)估與記錄大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足爪腫脹度。關(guān)節(jié)炎指數(shù)按 5 級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，0級(jí)：無(wú)紅腫；1級(jí)：趾關(guān)節(jié)紅腫；2級(jí)：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3級(jí)：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4級(jí)：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。累積四肢的評(píng)分，其最大值為16。足爪腫脹度使用足爪腫脹儀每3 d測(cè)定3次大鼠繼發(fā)側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)以下容積，以致炎前后容積差的平均值為腫脹度。稱(chēng)量每只大鼠的體質(zhì)量，處死大鼠后，取出并稱(chēng)重大鼠的脾臟和胸腺，計(jì)算脾臟指數(shù)(脾臟重量/體質(zhì)量)和胸腺指數(shù)(胸腺重量/體質(zhì)量)。

1.2.4ELISA法檢測(cè)大鼠外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和PGE2 的含量 收集各組大鼠外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用大鼠IL-6、PGE2 ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、PGE2水平。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的極化情況 取出各組大鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，4 h后移去培養(yǎng)液(體外實(shí)驗(yàn)中取出正常雄性大鼠腹腔巨噬細(xì)胞均勻鋪于6孔板，4 h后換液，加入IL-6、PGE2刺激劑培養(yǎng)24 h)，加入預(yù)冷的PBS，靜置15 min后，輕輕吹打，收集細(xì)胞于EP管中。2 500 r·min-1，10 min離心，去除上清液，加入80 μL 的細(xì)胞固定液，避光孵育10 min。加入600 μL PBS后2 500 r·min-1，10 min離心，棄去上清。加入80 μL的細(xì)胞破膜液，避光孵育10 min。除了空白對(duì)照組，其余每個(gè)EP管中加入CD68、CD86和CD206抗體，室溫孵育1 h，加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入150 μL的PBS重懸，過(guò)濾網(wǎng)后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中p-STAT3的入核情況 同上述1.2.5步驟處理細(xì)胞后，加入p-STAT3抗體室溫孵育1 h，加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入80 μL DAPI染核5 min，隨后加入600 μL PBS離心2 500 r·min-1，10 min，去上清，加入150 μL的PBS重懸，過(guò)濾網(wǎng)后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7激光共聚焦檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中GRK2與JAK1共定位及GRK2膜轉(zhuǎn)位情況 取出大鼠腹腔巨噬細(xì)胞后均勻鋪在24孔板中，板中放有無(wú)菌細(xì)胞爬片，培養(yǎng)4 h后，固定封閉處理細(xì)胞，孵育JAK1、GRK2抗體4℃過(guò)夜，PBS洗3 min×3次，吸干PBS，加入熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3 min×3 次，加入少量DAPI染核5 min，用PBS洗3 min×3次，挑片，滴上防熒光淬滅劑，將玻片正面倒置放在載玻片上，用指甲油固定住，隨后使用激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝。

1.2.8Western blot法檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3的表達(dá)和GRK2的膜表達(dá) 分離培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白。配制10%的SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、GRK2抗體4 ℃過(guò)夜，洗去一抗，孵育二抗37 ℃ 2 h,洗去二抗，隨后采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 CP-25對(duì)CIA大鼠全身情況的影響課題組前期研究表明，CP-25對(duì)小鼠CIA和大鼠AA治療作用有明顯量效關(guān)系[10-11]，且在50 mg·kg-1·d-1療效明顯，因此，在本研究中我們給予CIA大鼠CP-25(50 mg·kg-1·d-1)連續(xù)21 d進(jìn)行整體效果觀察實(shí)驗(yàn)。與正常組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P<0.05)，與模型組相比，CP-25與MTX給藥組大鼠體重明顯升高(P<0.05)(Fig 1A)。造模后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐步上升，于d 27達(dá)到高峰；與模型組相比，從d 30開(kāi)始，CP-25、MTX組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低(P<0.01)(Fig 1B)。造模后，除正常組外，各組大鼠足爪腫脹度逐步上升，于d 27達(dá)到高峰；與正常組相比，模型組大鼠足爪腫脹度明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，CP-25、MTX組大鼠足爪腫脹度降低(P<0.05)(Fig 1C)；與正常組相比，模型組大鼠胸腺、脾臟明顯腫大，指數(shù)升高(P<0.05)，與模型組相比，CP-25、MTX組胸腺、脾臟指數(shù)降低(P<0.05)(Fig 1D)。上述結(jié)果進(jìn)一步提示，CP-25對(duì)CIA大鼠有明顯治療效果。

Fig 1 Global data and organ index of CIA rats n=6)

2.2 CP-25對(duì)CIA大鼠外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6和PGE2含量的影響與正常組相比，模型組大鼠外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6、PGE2含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，CP-25組明顯降低腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6、PGE2含量及外周血血清中PGE2含量(P<0.05)。MTX組明顯降低外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6、PGE2含量(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Levels of IL-6 and PGE2 measured by ELISA in peripheral blood serum and cell supernatant ( n=6)

2.3 CP-25影響CIA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的極化情況炎癥情況下，巨噬細(xì)胞向M1型極化，為了驗(yàn)證CP-25是否通過(guò)減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而緩解炎癥，因此采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86/CD206來(lái)反映巨噬細(xì)胞極化情況。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CD86/CD206明顯增多(P<0.05)，與模型組相比，CP-25、MTX組CD86/CD206明顯降低(P<0.01)(Fig 3)，提示CP-25、MTX可使模型組巨噬細(xì)胞向M2型極化。

Fig 3 The polarization of peritoneal macrophages in CIA model determined by flow cytometry n=6)

2.4 CP-25對(duì)CIA鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路及GRK2表達(dá)的影響進(jìn)一步探討影響巨噬細(xì)胞功能異常的相關(guān)機(jī)制，采用Western blot法檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路上蛋白的變化。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞p-JAK1、p-STAT3表達(dá)明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，CP-25組p-JAK1、p-STAT3表達(dá)明顯降低(P<0.05)(Fig 4A)。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察了GRK2在腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)及GRK2與JAK1之間共定位情況。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞GRK2發(fā)生明顯膜轉(zhuǎn)位。與模型組相比，CP-25組GRK2膜轉(zhuǎn)位情況減少(Fig 4B)。與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中GRK2與JAK1共定位結(jié)合率明顯升高(P<0.01)、GRK2明顯向胞膜轉(zhuǎn)移。與模型組相比，CP-25組GRK2與JAK1共定位結(jié)合率明顯降低(P<0.01)(Fig 5)。通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中p-STAT3入核情況，與正常組相比，模型組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中p-STAT3入核率明顯升高(P<0.01)，與模型組相比，CP-25組p-STAT3入核率明顯降低(P<0.01)(Fig 6)。提示GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，降低對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用，CP-25減少了GRK2膜轉(zhuǎn)位，恢復(fù)GRK2對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用。

Fig 4 Effect of CP-25 on p-JAK1, p-STAT3 and membrane GRK2 expression of peritoneal macrophages in CIA model n=6)

Fig 5 The colocalization rate about GRK2 with JAK1 of peritoneal macrophages in CIA model determined by laser confocal scanning microscope

Fig 6 The p-STAT3 nuclear translocation of peritoneal macrophages in CIA model determined by Imaging flow cytometry

2.5 CP-25在體外對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化情況的影響基于上述整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)炎癥情況下，IL-6、PGE2明顯升高，JAK1/STAT3信號(hào)通路被激活，GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，因此將IL-6(100 μg·L-1)、PGE2(10 μmol·L-1)刺激腹腔巨噬細(xì)胞24 h，采用CP-25(100 nmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1)和JAK抑制劑托法替布(10 μmol·L-1)為給藥組，給藥24 h,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86/CD206的比例，與Control組相比，IL-6+PGE2組CD86/CD206明顯升高(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組CD86/CD206明顯降低(P<0.01)(Fig 7)，提示CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)可使IL-6聯(lián)合PGE2刺激后的巨噬細(xì)胞向M2型極化。

Fig 7 Effect of CP-25 on polarization of peritoneal

2.6 CP-25在體外對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中JAK1/STAT3信號(hào)通路及GRK2表達(dá)的影響激光共聚焦結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-6+PGE2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中GRK2與JAK1共定位結(jié)合率明顯降低(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組GRK2與JAK1共定位結(jié)合率明顯升高(P<0.01)(Fig 8)。提示IL-6聯(lián)合PGE2刺激后，巨噬細(xì)胞中GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，與JAK1之間相互作用減少。CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)可抑制IL-6聯(lián)合PGE2刺激后的巨噬細(xì)胞中GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，增加與JAK1之間的相互作用。Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，IL-6+PGE2組p-JAK1、p-STAT3的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，GRK2的膜表達(dá)明顯升高(P<0.01)，胞質(zhì)表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組p-JAK1、p-STAT3表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而GRK2 的膜表達(dá)明顯降低(P<0.01)，胞質(zhì)表達(dá)明顯升高(P<0.01)(Fig 9)。提示IL-6聯(lián)合PGE2刺激后，能明顯增加GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，降低GRK2對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用，而激活巨噬細(xì)胞上的JAK1/STAT3信號(hào)通路。CP-25(10 μmol·L-1)可顯著抑制IL-6聯(lián)合PGE2刺激后的巨噬細(xì)胞中GRK2的膜轉(zhuǎn)位。成像流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，與Control組相比，IL-6+PGE2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中p-STAT3入核率明顯升高(P<0.01)。與IL-6+PGE2組相比，CP-25(10 μmol·L-1)和托法替布(10 μmol·L-1)組p-STAT3入核率明顯降低(P<0.01)(Fig 10)。由上述結(jié)果可知，IL-6聯(lián)合PGE2刺激后，能明顯增加GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，降低GRK2對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用，激活了巨噬細(xì)胞上的JAK1/STAT3信號(hào)通路。而CP-25(10 μmol·L-1)通過(guò)減少GRK2膜轉(zhuǎn)位，發(fā)揮對(duì)JAK1/STAT3的抑制作用。

Fig 8 The colocalization rate about GRK2 with JAK1 of peritoneal macrophage in vitro experiments determined by laser confocal scanning

Fig 9 Effect of CP-25 on p-JAK1, p-STAT3 and membrane GRK2 expression of peritoneal macrophage in vitro

Fig 10 The p-STAT3 nuclear translocation of peritoneal macrophage in vitro experiments determined by Imaging flow cytometry

3 討論

目前，已有多項(xiàng)研究表明，CP-25具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，可明顯改善AA和CIA大小鼠炎癥情況，緩解足爪關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生、骨侵蝕等，已證實(shí)其主要是通過(guò)抑制CRK2轉(zhuǎn)膜，進(jìn)而影響多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)滑膜和免疫細(xì)胞的異常功能，如通過(guò)影響PGE2-EP4-cAMP調(diào)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)的增殖和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的極化[5，12]。

有大量研究表明JAK/STAT信號(hào)通路在RA滑膜組織中明顯被激活，STAT3可能在炎癥性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用，已證實(shí)其激活與發(fā)生滑膜增生、慢性炎癥和骨損傷等關(guān)節(jié)病理相關(guān)[13-15]。目前，已有JAK抑制劑用于RA的治療如托法替布，然而該類(lèi)藥物價(jià)格昂貴，不良反應(yīng)多，特別是增加了嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，通過(guò)對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路相應(yīng)調(diào)節(jié)的研究，使CP-25從分子機(jī)制上成為治療RA的有效藥物，增加臨床患者用藥選擇，極具臨床價(jià)值。但CP-25是否通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路治療關(guān)節(jié)炎，且其作用的具體機(jī)制尚不清楚。

在RA患者的滑膜液和關(guān)節(jié)組織中浸潤(rùn)著大量巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞處于M1/M2型比例失衡情況，釋放出大量促炎細(xì)胞因子如PGE2、IL-6，加重炎癥和關(guān)節(jié)破壞。最近的研究表明，IL-6的產(chǎn)生和分泌可以通過(guò)JAK1、TYK2、STAT3和/或STAT4參與一個(gè)自分泌反饋回路，推動(dòng)促炎介質(zhì)在RA-FLS中的持續(xù)激活和分泌[16]。我們通過(guò)建立大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型，檢測(cè)大鼠外周血血清和腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6及PGE2的含量，發(fā)現(xiàn)炎癥情況下，IL-6、PGE2含量上升，且巨噬細(xì)胞明顯向M1型極化，GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，p-STAT3入核增多，p-JAK1、p-STAT3水平升高。提示IL-6、PGE2可通過(guò)增強(qiáng)GRK2膜轉(zhuǎn)位，激活JAK1/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，進(jìn)而增加IL-6、PGE2的分泌，形成一個(gè)炎癥循環(huán)。而且我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)IL-6聯(lián)合PGE2可明顯增強(qiáng)GRK2膜轉(zhuǎn)位，激活JAK1/STAT3信號(hào)通路，原代大鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化，p-STAT3入核增加，與體內(nèi)結(jié)果一致。

我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CP-25可以抑制GRK2膜轉(zhuǎn)位，增加GRK2與JAK1的共定位結(jié)合率，在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CP-25可以明顯增加IL-6聯(lián)合PGE2刺激巨噬細(xì)胞后減少的JAK1與GRK2的共定位結(jié)合率，增加GRK2胞質(zhì)表達(dá)量，減少p-JAK1表達(dá)量。由此，得出在炎癥情況下，GRK2發(fā)生膜轉(zhuǎn)位，減少與JAK1之間相互作用，降低其對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用，JAK1/STAT3信號(hào)通路明顯激活，促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展。CP-25通過(guò)抑制GRK2膜轉(zhuǎn)位，增加GRK2與JAK1之間的相互作用，發(fā)揮抑制JAK1/STAT3信號(hào)通路的作用。但是GRK2與JAK1之間相互作用的具體方式尚需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)了CP-25可以通過(guò)調(diào)控GRK2的活性，發(fā)揮調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)通路的作用，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化。該研究為CP-25成為治療RA的抗炎免疫調(diào)節(jié)藥物提供理論依據(jù)。