TEOA誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡機(jī)制分析

解蓓 李艷純 王瑩 杜璟 陸曉雅 王劍超*

急性髓系白血?。ˋML）是一種常見的血液惡性腫瘤，其特征在于原始或未成熟細(xì)胞的過度增殖以及對正常造血干細(xì)胞的抑制［1］。據(jù)報(bào)道，AML的5年生存率（OS）極低，在年輕患者和老年患者中分別為40%，10%~20%［2］。而達(dá)到完全緩解（CR）后復(fù)發(fā)的患者也大多存活不到5年［3］。AML的治療方式主要包含誘導(dǎo)化療，靶向治療和同種異體造血干細(xì)胞移植（HSCT），其中阿糖胞苷和蒽環(huán)類藥物的聯(lián)合使用始終是AML誘導(dǎo)化療的基礎(chǔ)［4］。雖然誘導(dǎo)化療能夠部分改善年輕AML患者的預(yù)后，但大多數(shù)患者最終會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遭受化療所帶來的貧血、出血和感染等嚴(yán)重的毒副作用并最終死于該疾?。?］。而同種異體造血干細(xì)胞移植所帶來的并發(fā)癥，更是威脅患者的生命，整體預(yù)后較差［6］。2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（TEOA）具有抗肝炎、抗水腫、抗結(jié)核等多種功能［7］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)TEOA在多種腫瘤細(xì)胞，包括SW620、BGC823、HepG、A549和PC-3等細(xì)胞中均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用［8］。本文探討TEOA對人急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 RPMI 1640 、IMDM培養(yǎng)液購于美國Gibco公司，TEOA自制，抗P53、抗PARP、抗BaX、抗Bcl-2和抗c-Caspase3 抗體購自英國Abcam公司。碘化丙啶（批號ST511）、CCK-8試劑盒（批號C0043）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號A0216）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號A0208）均購于上海碧云天生物科技公司，二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購于天津?yàn)I韻科技公司。ECL顯影液（批號FD8020）購于杭州弗德生物科技有限公司，離心機(jī)購于美國Thermo公司，普通倒置顯微鏡、正置熒光顯微鏡購于日本尼康公司，酶標(biāo)檢測儀購于瑞士Tecan公司。凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人急性髓系白血病Kasumi-1、KG-1α細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的 RPMI 1640和IMDM培養(yǎng)液，在37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8檢測 選取對數(shù)生長期的Kasumi-1、KG-1α細(xì)胞，用無血清RPMI 1640和IMDM培養(yǎng)液配成4×104/ml懸液，吸取100 μl至96孔板中，然后放至37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，同時(shí)以10 mmol/L的TEOA為初始濃度，用無血清RPMI 1640和IMDM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋配制不同濃度的TEOA，然后等量加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不加TEOA的對照組和只加培養(yǎng)液的空白組，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)箱孵育。經(jīng)加藥24 h后避光加入等量CCK-8試劑，充分搖蕩混勻，繼續(xù)孵育4 h后，用酶標(biāo)儀測得各個(gè)孔在波長為450 nm處的吸光度值（OD）。然后分別計(jì)算出各組的細(xì)胞存活率和IC50值。細(xì)胞存活率（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。應(yīng)用 Graphpad Prism 8.0軟件將測得的數(shù)據(jù)整理繪制成細(xì)胞活力曲線。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取Kasumi-1細(xì)胞株為作用對象。

1.4 碘化丙啶（PI）染色 為了評估TEOA對Kasumi-1細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用PI染色法在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的死亡情況。按同樣密度將Kasumi-1細(xì)胞接種到96孔板中，根據(jù)上述CCK-8檢測結(jié)果將Kasumi-1細(xì)胞分為以下4組，對照、TEOA（20 μmol/L）組，TEOA（30 μmol/L）組、TEOA（40 μmol/L）組。在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，向每孔添加終濃度為10 μg/ml的PI染色液，繼續(xù)孵育10 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核釋放的紅色熒光，紅色熒光的多少即代表細(xì)胞死亡量。

1.5 Western blot 檢測 將Kasumi-1細(xì)胞分為對照組、TEOA（10 μmol/L）組、TEOA（20 μmol/L）組，處理24 h后低溫提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，然后取等量蛋白上樣至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，用TBST緩沖液洗滌3次，然后根據(jù)Marker裁剪出目的蛋白相應(yīng)大小的條帶，并加入β-actin、P53、PARP、c-Caspase3、BaX、Bcl-2蛋白的抗體，于4 ℃ 搖床孵育過夜后將抗體回收，再次用TBST緩沖液洗滌條帶3次，然后分別加入山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗繼續(xù)室溫?fù)u床孵育1 h，再次洗滌，加入ECL試劑顯影，最后用凝膠成像儀曝光分析。

1.6 活性氧（ROS）水平的檢測 以4×105細(xì)胞/ml的密度將Kasumi-1細(xì)胞接種于六孔板，然后加入配制好的20、30、40 μmol/L的TEOA藥物，并設(shè)置對照組，處理24 h后，向每孔加入終濃度為2 μmol/L的DCFHDA，繼續(xù)避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測DCF熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)ROS水平與DCF熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TEOA對Kasumi-1、KG-1α細(xì)胞的增殖抑制作用 與對照組比較，隨著TEOA濃度的增加，Kasumi-1和KG-1α細(xì)胞活力均逐漸下降（P<0.05），TEOA作用于Kasumi-1細(xì)胞在24 h的IC50值是26.71 μmol/L；同樣濃度的TEOA作用于KG-1α細(xì)胞在24 h的IC50值是25.78 μmol/L（見圖1）。

圖1 不同質(zhì)量濃度的TEOA對Kasumi-1和KG-1α細(xì)胞活力的影響

2.2 TEOA誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡 PI染色結(jié)果：分別以20、30、 40 μmol/L的TEOA作用Kasumi-1細(xì)胞24 h后，與0 μmol/L的TEOA組比較，隨著濃度的增加，Kasumi-1細(xì)胞死亡數(shù)量也在逐漸增加（見圖2A）。通過Western blot驗(yàn)證TEOA作用于Kasumi-1細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與0 μmol/L的TEOA組比較，不同濃度的TEOA處理Kasumi-1細(xì)胞后，抑癌基因P53和下游促凋亡蛋白c-Caspase3、Bax、Cleaved-PARP表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)下降（見圖2B、2C）。

圖2 A. PI染色觀察Kasumi-1細(xì)胞死亡的特征；B. Western blot檢測TEOA對Kasumi-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響；C. Western blot檢測凋亡蛋白在Kasumi-1細(xì)胞中的相對表達(dá)

2.3 TEOA對Kasumi-1細(xì)胞ROS生成影響 與0 μmol/L的TEOA組比較，20 μmol/L的TEOA作用于Ka sumi-1細(xì)胞時(shí)，ROS生成的相對量為（1.45±0.14）%；30 μmol/L的TEOA作用時(shí)，ROS生成的相對量為（1.9±0.07）%，而40 μm ol/L的TEOA作用時(shí)，ROS生成的相對量為（2.43±0.08）%（P<0.05）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測TEOA誘導(dǎo)kassumi-1細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧水平

3 討論

TEOA是從中華獼猴桃的根中分離的一種熊果酸型五環(huán)三萜類化合物，含量最為豐富。據(jù)報(bào)道五環(huán)三萜類化合物及其衍生物具有多種生物學(xué)作用，如抗腫瘤，抗炎癥，抗病毒和抗氧化等功能，其中抗腫瘤活性得到廣泛認(rèn)可［9］。如羽扇豆醇是常見的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物，張玲莉等［10］等研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇能通過活化Caspase通路，上調(diào)P53表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及周期改變，抑制高轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌HCCLM3細(xì)胞的增殖。齊墩果酸（OA）是一種常見的果烷型五環(huán)三萜類化合物，有研究表明OA可以誘導(dǎo)膽囊癌GBC-SD和NOZ兩種細(xì)胞線粒體依賴性凋亡和G0/G1周期阻滯［11］。ZHANG［8］等研究證實(shí)TEOA對人類結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞具有抗腫瘤活性，其作用機(jī)制與ROS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和線粒體自噬相關(guān)。

細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制失衡導(dǎo)致的不可控的細(xì)胞生長是大多數(shù)癌癥進(jìn)展的原因，因此抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為評估抗癌藥物療效的重要因素［12］。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，TEOA可明顯抑制Kasumi-1和KG-1α細(xì)胞的增殖，且呈濃度依賴性。隨后應(yīng)用PI染色證實(shí)，與對照組相比，不同濃度的TEOA均可促進(jìn)Kasumi-1細(xì)胞的死亡，且TEOA作用濃度在30 μmol/L時(shí)大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡。本資料顯示，通過Wesrern blot檢測發(fā)現(xiàn)TEOA作用于Kasumi-1細(xì)胞后Caspase3活化片段C-Caspase3，C-PARP明顯激活，Caspase激活被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的標(biāo)志［13］。因此，TEOA能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖，且其凋亡信號通路可能與胱氨酸蛋白酶有關(guān)。YUXINGXING［14］研究發(fā)現(xiàn)TEOA通過促進(jìn)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS從而誘導(dǎo)DNA損傷和P38活化而發(fā)揮抗腫瘤作用。在正常生理?xiàng)l件下，ROS在人體內(nèi)以氧化代謝副產(chǎn)物的形式不斷產(chǎn)生，且能被抗氧化劑清除［15］。但過量的ROS會(huì)對一些生物大分子造成損害，如DNA和蛋白質(zhì)等［16］。越來越多的研究證實(shí)，ROS的過度積聚可通過內(nèi)外凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本資料結(jié)果顯示，TEOA以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS，提示ROS的產(chǎn)生可能是TEOA誘導(dǎo)的Kasumi-1細(xì)胞凋亡的原因。P53作為腫瘤抑制基因，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控著大量的靶基因，從而在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，包括DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡等［18］。據(jù)報(bào)道，在ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，P53作為下游調(diào)控因素發(fā)揮重要作用［19］。Bcl-2家族蛋白成員是線粒體依賴的內(nèi)在凋亡途徑的重要因子，包括促凋亡蛋白代表Bax和抗凋亡蛋白代表Bcl-2。本實(shí)驗(yàn)通過Wesrern blot檢測發(fā)現(xiàn)TEOA誘導(dǎo)的kasumi-1細(xì)胞可明顯促進(jìn)P53和Bax基因的表達(dá)，降低Bcl-2的蛋白表達(dá)。此外ROS還被認(rèn)為是通過與Bcl-2家族蛋白相互作用而激活多個(gè)氧化還原敏感信號級聯(lián)的第二信使［20］。綜上所述，TEOA可能通過上調(diào)ROS水平進(jìn)而激活P53凋亡通路促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡。TEOA可能是治療急性髓系細(xì)胞白血病的一種有前途的候選藥物。