耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的耐藥基因及同源性分析

陳晨 周俊英 李一榮 楊京冬

近年來由于抗菌藥物的不合理使用，使得臨床分離的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性逐漸降低，給臨床抗感染治療帶來困難。目前臨床上最受重視的是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌，其中以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌與人們的生活緊密相關(guān)［1-2］，碳青霉烯類藥物不合理使用導(dǎo)致出現(xiàn)了耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（Carbap-enem resistant Enterobacteriaceae，CRE）［3-4］。腸桿菌基因間重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergen-ic consensus sequence，ERIC）廣泛存在于腸道細(xì)菌中，長(zhǎng)約124～127 bp［5］，其中存在高度保守長(zhǎng)約40 bp 的核心序列，兩個(gè)重復(fù)序列在腸道細(xì)菌基因組中存在著屬、種、株水平上的分布和拷貝數(shù)量的差異，這些重復(fù)序列本身在進(jìn)化過程中具有較強(qiáng)的保守性，ERIC-PCR 具有快速、簡(jiǎn)單、分辨率高和使用設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［6］，使得它在細(xì)菌分類、分子微生物生態(tài)學(xué)研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究采取微生物鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行CRE 的判定，挑選對(duì)亞胺培南不敏感的腸桿菌科細(xì)菌，改良Hodge 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表型篩選，PCR 檢測(cè)CRE 菌株的五種常見耐藥基因（KPC、VIM、IMP、NDM和OXA）。選取17株分離自ICU 的基因型均為KPC 的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Enterobacteria-ceaeKlebsiella pneumoniae，CRKP）進(jìn)行ERIC-PCR和同源性分析，判斷重癥醫(yī)學(xué)科室內(nèi)的CRKP 菌株是否為同一亞型或同一克隆株，從而了解細(xì)菌的流行病學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

通過法國(guó)梅里埃VITEK 2 COMPACT 對(duì)本院2017年2月至2017年11月間60 株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）進(jìn)行鑒定，藥敏結(jié)果參照CLSIM100（2017），且改良Hodge 實(shí)驗(yàn)［7］初篩結(jié)果為陽性；細(xì)菌經(jīng)鑒定后置-40℃恒溫冰箱中保存，改良Hodge 實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.1.2 試劑和儀器

美羅培南、亞胺培南、厄他培南由英國(guó)OXOID公司提供，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）DP302，Taq 酶、dNTPs、MgCl2、10x buffer（Mg+2 plus/free）DNA 100 bp/DS5000 Marker，由天根生化科技（北京）有限公司提供，PCR 引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。Bio-Rad 普通PCR 儀（Bio-Rad 公司/美國(guó)），NanoDrop 2000（Thermo Scientific/美國(guó)），電泳儀（PAC3000）和紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)儀（Bio-Rad 公司/美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的選取

選取60 株Hodge 實(shí)驗(yàn)為陽性的CRE 菌株，標(biāo)本的分離培養(yǎng)與鑒定操作依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作流程》（第四版）［8］進(jìn)行。

1.2.2 改良Hodge 實(shí)驗(yàn)

以厄他培南為底物紙片進(jìn)行改良Hodge 實(shí)驗(yàn)，陰性結(jié)果再用美羅培南與亞胺培南紙片。以大腸埃希菌ATCC25922 為陰性對(duì)照，若任一藥敏紙片被測(cè)菌株與大腸埃希菌ATCC25922 抑菌圈交匯處出現(xiàn)大腸埃希菌生長(zhǎng)增強(qiáng)的現(xiàn)象，即可記錄為改良Hodge 實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.2.3 細(xì)菌DNA 提取

按照天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方法可見天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型），DP302 型號(hào)說明書。

將DNA 收集到離心管中，按照NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)中文操作手冊(cè)檢測(cè)DNA 濃度、純度并記錄。并將提取DNA 作為后續(xù)PCR 反應(yīng)模板于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 引物合成序列

KPC、IMP、OXA-48、VIM、NDM 5 種PCR 引物序列見表1。

表1 碳青霉烯酶基因所用的PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence of carbapenase gene

1.2.5 耐藥基因擴(kuò)增

擴(kuò)增體系：Buffer 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTPs 1 μL，引物F 和R 各1 μL，Taq（5 U/μL）1.5 μL，DNA 2 μL，H2O214.5 μL。IMP 的反應(yīng)條件為：94℃變性10 min；94℃30 s，55℃40 s，72℃50 s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；KPC 的反應(yīng)條件為：94℃變性10 min；94℃30 s，56℃40 s，72℃50 s，36 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；OXA、VIM 及NDM 的反應(yīng)條件為：94℃變性10 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。電泳參數(shù)為90 V，20 min。

1.2.6 腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR 與同源性分析

采用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）進(jìn)行基因擴(kuò)增，ERIC-2 單引物序列為AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG（5′-3′）［9］。

反應(yīng)體系：Buffer 2 μL，Mg2+1.25 μL，dNTPs 1.6 μL，引物1 μL，Taq（5 U/μL）0.6 μL，DNA 1 μL，H2O212.55 μL；反應(yīng)條件為：94℃變性5 min；94℃30 s，44.5℃45 s，72℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。選取17 株基因型為KPC 的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）進(jìn)行同源性分析，采用生物信息分析軟件（Bionumerics）圖像分析軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析，判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照Tenover［10］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，①圖譜完全相同為一個(gè)型；②相差一個(gè)帶為同一型的不同亞型；③相差2～3 個(gè)帶為緊密相關(guān)；④相差4～6 個(gè)帶為可能相關(guān)；⑤相差7 個(gè)以上條帶為無親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的種類與臨床分布

60 株CRE 中包括肺炎克雷伯菌53 株（88.33%），大腸埃希菌3 株（5%），陰溝腸桿菌3 株（5%），弗氏檸檬酸桿1 株（1.67%）；標(biāo)本以痰和纖支鏡灌洗液為主，痰和灌洗液分離出28 株，構(gòu)成比為46.67%，其次是尿液為16 株，構(gòu)成比為26.67%，傷口分泌物和血液為4 株，構(gòu)成比為6.67%、導(dǎo)管尖端和引流液，為3 株，構(gòu)成比為5.00%；科室分布主要是重癥醫(yī)學(xué)科，為21 株，其次新生兒科檢出7 株，呼吸及危重癥醫(yī)學(xué)科檢出8 株，血液科檢出5 株，泌尿外科檢出3 株，其他科室檢出16 株。

2.2 不同底物的改良Hodge 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以厄他培南（10 μg/片）紙片為底物對(duì)60 株CRE 菌株做改良Hodge 實(shí)驗(yàn)，檢出57 株厄他培南改良Hodge 實(shí)驗(yàn)陽性株。改良Hodge 試驗(yàn)結(jié)果。見圖1。

圖1 改良Hodge 試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Modified Hodge test results

再對(duì)剩余3 株未檢測(cè)出厄他培南底物紙片改良Hodge 實(shí)驗(yàn)陽性菌株，分別同時(shí)進(jìn)行亞胺培南與美羅培南改良Hodge 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 3 株改良Hodge 實(shí)驗(yàn)陰性的菌株結(jié)果Table 2 Results of 3 strains of modified Hodge negative

綜合3 種底物紙片結(jié)果，厄他培南改良Hodge實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)KPC型A 類碳青霉烯酶的菌株陽性率為100%（50 株/50 株），33.3%（3 株/9 株）的產(chǎn)NDM型B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株在厄他培南改良Hodge 實(shí)驗(yàn)中結(jié)果為陰性，但補(bǔ)充亞胺培南與美羅培南改良Hodge 實(shí)驗(yàn)后仍可鑒定為陽性株。

2.3 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

60株CRE中有58株擴(kuò)增出相關(guān)耐藥基因。KPC有50 株占86.21%，NDM 有9 株占15.52%，IMP 有2株占3.45%。同時(shí)擴(kuò)增出KPC和IMP的有2 株占3.45%，同時(shí)擴(kuò)增出KPC和NDM的有1 株占1.72%，其中60株均未擴(kuò)增出OXA-48、VIM。見圖2。

圖2 五種耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR results of five drug-resistant genes

2.4 ERIC-PCR 同源性分析

應(yīng)用bionumerics 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。以相關(guān)系數(shù)（±0.50～±0.80）為顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（±0.80～±1.00）為高度相關(guān)。17 株CRKP 的擴(kuò)增結(jié)果可聚為3 類。菌株14、16、10、13、17、8 可聚為一大類：其中菌株8 和17 親緣關(guān)系最近，相關(guān)系數(shù)最高達(dá)到了0.76，菌株14 和16 相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.75，菌株10 和16 相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.71，這3 對(duì)菌株表現(xiàn)出較高的同源性；菌株11、15聚為一類：相關(guān)系數(shù)為0.57，顯著相關(guān)；菌株2、4、12、1、5、6、3、9、7 另聚為一大類：其中菌株1 和12相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.72，表現(xiàn)出較高的同源性。見圖3。

圖3 CRKP 的同源性分析Figure 3 Romology analysis of CRKP

3 結(jié)論

60 株CRE 菌株中，以肺炎克雷伯菌為主占88.33%；標(biāo)本類型主要為呼吸道標(biāo)本（痰及支氣管灌洗液）占46.67%，尿液、血液等樣本均有分離，這提示可能存在多部位感染；科室以重癥監(jiān)護(hù)室為主占35%，廣譜抗菌素的使用及支氣管鏡等侵入性操作是感染CRE 的主要高危因素［11］，醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)院內(nèi)感染管理工作，通過隔離感染者、對(duì)細(xì)菌耐藥進(jìn)行網(wǎng)報(bào)監(jiān)管、手衛(wèi)生、以及加強(qiáng)病區(qū)環(huán)境與器材的消毒等措施控制院內(nèi)感染的發(fā)生。

CRE 的耐藥基因型以KPC（86.21%）和NDM（15.52%）為主，這與陸［12］等的以KPC和IMP結(jié)論有所不同，推測(cè)可能與地域有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CRE 菌株存在一定的多重耐藥基因情況，58 株CRE 菌株中，有3 株同時(shí)存在2 種耐藥基因占5.17%，CRE 菌株的多重耐藥將給臨床用藥治療帶來更大困難與風(fēng)險(xiǎn)，臨床醫(yī)生在治療時(shí)應(yīng)慎重使用抗菌藥物。另有兩株菌株未檢出KPC、NDM、IMP、VIM與OXA這五種基因型中的任何一種，可能屬于少見的耐藥基因型，有待進(jìn)一步研究。

自ICU 分離的17 株CRKP 表現(xiàn)出較高的同源性，相關(guān)系數(shù)最高的2 菌株達(dá)到0.76，但未見同一克隆株的暴發(fā)流行，這提示醫(yī)院仍要繼續(xù)加強(qiáng)院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)與防護(hù)，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員的培訓(xùn)管理，一旦發(fā)現(xiàn)患者有耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌感染或定植，應(yīng)將該患者進(jìn)行隔離，規(guī)范抗菌藥物的合理使用，同時(shí)對(duì)CRKP 的流行趨勢(shì)進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)控從而避免多重耐藥菌株所產(chǎn)生的“無藥可用”的嚴(yán)重后果。