電針聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷大鼠血管新生作用機制研究*

王秀珍，鄒 偉，馬育軒，趙 楠，高長玉，王特哈斯，彭宇飛△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、溶栓治療能夠減少心肌梗死面積和挽救瀕死心肌，但是在恢復(fù)血供后損傷反而愈加嚴(yán)重，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[1]。介入和藥物治療雖然取得了一定進(jìn)展，但患者疾病后期還可能出現(xiàn)血管再狹窄、閉塞等現(xiàn)象。因此，血管新生“自身搭橋”成為目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)經(jīng)誘導(dǎo)可分化為心肌細(xì)胞，促進(jìn)心肌修復(fù)。受梗死區(qū)域微環(huán)境的影響,BMSCs分化為心肌細(xì)胞十分困難，因此尋找一種可靠的誘導(dǎo)方法是本課題研究的關(guān)鍵?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)可能存在細(xì)胞毒性；中藥復(fù)方成分復(fù)雜，在應(yīng)用前需要做細(xì)胞毒性鑒定；而針灸具有無毒、無副作用的特點。因此本課題通過制備MIRI模型，選用電針作為誘導(dǎo)方法觀察BMSCs移植后促進(jìn)梗死區(qū)域血管新生狀況，為電針調(diào)控BMSCs向心肌細(xì)胞分化、遷移和歸巢提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

選用4～6周SPF級SD大鼠10只，體質(zhì)量(100±10)g,用于提取BMSCs；SPF級SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量(200±10)g,用于移植，上述實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[合格證號為：SCXK(黑)2016004]，通風(fēng)，普通飼養(yǎng)，實驗過程按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》文件要求執(zhí)行。

1.2 實驗儀器

流式細(xì)胞儀(美國Milipore);倒置相差顯微鏡(美國SCILOGEX);TC2323二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SL);超純水儀(美國密理博公司);低溫高速離心機MIKRO 220(德國Hettich公司);HX-200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司);2135型切片機(德國菜卡公司);Glamour 2000型全自動生化儀(美國M.D.儀器公司)。

1.3 實驗試劑

青霉素鏈霉素溶液(Hyclone公司);特級胎牛血清(Hyclone公司);胰酶細(xì)胞消化液(Beyotime公司);MTT(美國Sigma);CD90、CD45(美國eBioscience);DMSO(中國凱基);CK-MB、cTnI試劑盒(南京建成生物工程有限公司);TTC(美國Sigma公司)、抗熒光淬滅劑(中國Solarbio);酶標(biāo)儀(美國BIOTEK);Image-pro plus6.0分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

1.4 BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

1%戊巴比妥那腹腔麻醉大鼠，頸椎脫臼法處死，消毒，剪斷脛骨和股骨兩側(cè)骺端，充分暴露髓腔，采用全骨髓貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)。方法：加入濃度為15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，在溫度37 ℃、濃度為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，標(biāo)記為第一代(P0)，P0代細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)48 h后，首次半量換液，剔除懸浮液，以后每2～3 d全量換液1次，每日于鏡下觀察BMSCs融合及生長形態(tài)情況,待P1代細(xì)胞融合達(dá)80%～90%左右，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后進(jìn)行傳代，按1∶2比例傳代，標(biāo)記為P2代，以此類推，P3代細(xì)胞長滿后，用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原。

2 方法

2.1 造模方法

術(shù)前禁食、不禁水12 h，1%戊巴比妥那腹腔麻醉，行氣管插管術(shù)，呼吸機輔助通氣(通氣頻率約50次/min)，心臟暴露充分，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，拉緊并固定縫合線。觀察心電圖變化，Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段抬高、T波高聳和倒置，提示心肌缺血形成。30 min后松開止血鉗，恢復(fù)再灌注60 min，再灌注損傷成功標(biāo)志以Ⅱ?qū)?lián)上抬的ST段下降50%或高聳的T波下降為準(zhǔn)。

2.2 分組及移植

將大鼠隨機分為5組，每組6只。分別為假手術(shù)組、模型組、電針組、BMSCs組和電針+BMSCs組。假手術(shù)組：只穿線不結(jié)扎；模型組：行心肌MIRI造模，造模成功后在缺血區(qū)以心尖方向為6點方向，分別在3點、6點和9點3個位點注射生理鹽水；電針組：MIRI造模成功后，給予電針治療，參照相關(guān)文獻(xiàn)等[2-3]制定的《實驗動物穴位圖譜》取穴，內(nèi)關(guān)穴定位(PC6)：前肢內(nèi)側(cè)離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間，用0.30 mm×25 mm毫針針刺，針刺深度約5 mm，雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴接正極，“內(nèi)關(guān)”穴近心端上約1.5 mm處刺入一根毫針接負(fù)極，連接電針疏密波(疏波2 Hz，密波100 Hz)刺激，強度以局部呈現(xiàn)稍微振動為宜，治療30 min，1次/d；BMSCs組：造模成功后，立即在心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)3個點各注射BMSCs細(xì)胞25 μL(細(xì)胞預(yù)先用CM-Dil標(biāo)記，細(xì)胞數(shù)目5×106)；電針+BMSCs組：造模成功后，移植方法同BMSCs組，電針治療同電針組。各組連續(xù)治療14 d，分3 d、7 d和14 d 3個時間點取材。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 BMSCs生長形態(tài) 待P1代細(xì)胞融合達(dá)80%～90%左右，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后進(jìn)行傳代，按1∶2比例傳代，標(biāo)記為P2代，以此類推，P3代細(xì)胞長滿后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

2.3.2 細(xì)胞生長趨勢 培養(yǎng)BMSC細(xì)胞至密度為90%左右，加入0.2%胰酶消化，置于37 ℃、5%CO2的條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，分別進(jìn)行MTT檢測。

2.3.3 BMSCs的鑒定 流式細(xì)胞儀檢測以CD45陽性率低于5%、CD90陽性率高于90%鑒定所得細(xì)胞為高純度的BMSCs。

2.3.4 CK-MB、cTnI含量的測定 各時相點治療結(jié)束后腹主動脈取血，離心機轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，收集血清，采用Glamour 2000型全自動生化儀檢測CK-MB、cTnI的含量。

2.3.5 大鼠心肌梗死面積 取厚度為1～2 mm心肌片，置于1%TTC染液中，4%多聚甲醛固定，拍照記錄，正常心肌染色呈紅色，壞死心肌呈灰白色。

2.3.6 心肌組織病理形態(tài) 各時相點結(jié)束后迅速取出心臟，切取約2 mm3心肌組織，4%多聚甲醛固定。包埋、逐級脫水、二甲苯透明、HE染色和鏡檢400倍下顯微鏡下觀察。

2.3.7 細(xì)胞移植存活狀態(tài) 切取約2 mm3心肌組織，包埋樣本，切取10 μm的薄片，蒸餾水浸洗，加抗熒光淬滅劑，鏡下400倍拍照。

2.3.8 CD31、SDF-1蛋白含量 取約2 mm×2 mm×2 mm心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、乙醇逐級脫水和二甲苯透明后，加入一抗、二抗，DAB顯色、蘇木素復(fù)染并在400倍鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 大鼠BMSCs體外生長的形態(tài)學(xué)特征

倒置顯微鏡下觀察24 h后絕大部分BMSCs已經(jīng)開始貼壁伸展生長，形態(tài)呈類圓形、梭型、多角形及星型等不規(guī)則形態(tài)且數(shù)目較多；約4～6 d后，生長速度顯著增加，形成細(xì)胞集落，每個集落由中心向四周融合成片，細(xì)胞形狀呈多角形、短梭形，形態(tài)呈“旋渦樣”生長。見圖1。

圖1 BMSCs倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

3.2 BMSCs生長曲線

BMSCs傳代后生長曲線在1～4 d左右迅速增殖，生長旺盛，5～7 d左右達(dá)到平臺期，此時細(xì)胞增殖達(dá)到高峰。見圖2。

圖2 BMSCs生長曲線

3.3 BMSCs表面抗原的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD45陽性率低于5%、CD90陽性率高于90%，提示細(xì)胞純度較高，均一性較好，符合后續(xù)實驗要求。見圖3。

圖3 BMSCs CD45、CD90的表達(dá)

3.4 各組大鼠心肌酶CK-MB、cTnI含量的變化

實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，其他各組各個時相點CK-MB、cTnI含量明顯升高，說明造模成功；與模型組比較，各治療組各個時相點CK-MB、cTnI含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較電針組和BMSCs組CK-MB、cTnI水平下降更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組CK-MB、cTnI呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；與再灌注3 d比較，7 d、14 d時CK-MB、cTnI水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較，14 dCK-MB、cTnI水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠各時相點CK-MB含量的變化

表2 各組大鼠各時相點cTnI含量的變化

3.5 各組大鼠心肌梗死面積的變化

實驗結(jié)果顯示，TTC染色后肉眼可見心肌梗死區(qū)呈現(xiàn)灰白色。與模型組比較，各治療組各時相點梗死面積明顯縮小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針+BMSCs組梗死面積與電針組和BMSCs組比較顯著較少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組梗死面積呈現(xiàn)逐漸縮小的趨勢；與再灌注3 d比較，再灌注7 d各治療組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，14 d各治療組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較,14 d梗死面積顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠各時相點心肌梗死面積的變化(%)

表3 各組大鼠各時相點心肌梗死面積的變化

3.6 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色顯示：假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)未見明顯異常；模型組可見細(xì)胞間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管擴張甚至心肌纖維出現(xiàn)斷裂和溶解等現(xiàn)象；電針組、BMSCs組和電針+BMSCs組未見有明顯的炎性細(xì)胞浸潤、腫脹,心肌纖維排列較為規(guī)則，說明損傷程度明顯減輕，電針+BMSCs組減輕尤其顯著。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化(14 d,400×)

3.7 熒光顯微鏡檢測BMSCs移植存活狀態(tài)

采用熒光顯微鏡下觀察，BMSCs組在心肌中呈現(xiàn)出良好的生長增殖狀態(tài)，隨著時間的延長BMSCs數(shù)目呈現(xiàn)遞增趨勢，電針+BMSCs組與之比較，效果更加明顯。見圖6。

圖6 移植組各時間點熒光顯微鏡檢測細(xì)胞移植存活狀態(tài)

3.8 免疫組化檢測CD31、SDF-1蛋白含量的變化

3.8.1 CD31標(biāo)記的微血管密度比較 CD31定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或包膜上，免疫組化染色后呈“棕黃色或黃褐色”即陽性表達(dá)，新生血管呈棕黃色。與假手術(shù)組比較，其他各組各時相點梗死邊緣區(qū)微血管密度(IOD值)均有不同程度的升高,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；再灌注3 d時，與模型組比較，BMSCs組、電針+BMSCs組IOD值明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針組升高不明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；再灌注7 d時，與模型組比較，電針組、電針+BMSCs組IOD值明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針+BMSCs組升高更為明顯，BMSCs組升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；再灌注14 d時各治療組微血管密度(IOD值)明顯升高(P<0.05)，其中電針+BMSCs組微血管密度(IOD值)明顯高于電針組及BMSCs組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖7。

表4 各組大鼠各時相點CD31 IOD值的變化

圖7 各組心肌組織中CD31蛋白表達(dá)水平(14 d，400×)

3.8.2 各組大鼠SDF-1蛋白含量變化 SDF-1定位于細(xì)胞胞質(zhì)，免疫組化染色后呈“棕黃色或黃褐色”即陽性表達(dá)，新生毛細(xì)血管呈棕黃色。與假手術(shù)組比較，其他各組各個時相點SDF-1蛋白含量明顯升高；與模型組比較，各治療組各個時相點SDF-1蛋白含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中電針+BMSCs組較電針組和BMSCs組SDF-1蛋白水平升高更加明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著時間延長，各治療組SDF-1蛋白呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；與再灌注3 d比較，7 d、14 d時SDF-1蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與再灌注7 d比較，14 d時SDF-1蛋白水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中以電針+BMSCs組療效更為顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖8。

表5 各組大鼠各時相點SDF-1 IOD值的變化

圖8 各組心肌組織中SDF-1蛋白表達(dá)水平(14 d，400×)

4 討論

心肌缺血再灌注損傷這一病名在中醫(yī)學(xué)中無記載，但是根據(jù)其臨床表現(xiàn)可以將其歸屬于“胸痹”“心痛”“厥心痛”“真心痛”等范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“邪客于足少陰之絡(luò)，令人卒心痛”，是中醫(yī)學(xué)對心血管內(nèi)科急癥較早的文獻(xiàn)記載?！鹅`樞·經(jīng)脈》曰：“心胸內(nèi)關(guān)謀 ”，《標(biāo)幽賦》曰：“胸滿腹痛刺內(nèi)關(guān)”。內(nèi)關(guān)穴屬手厥陰心包經(jīng)，通陰維，絡(luò)穴?！敖?jīng)脈所過，主治所及”，其有寧心安神、寬胸理氣之效，內(nèi)關(guān)穴治療缺血性心肌病具有經(jīng)穴特異性[4-7]。現(xiàn)代研究表明機體自身具有內(nèi)源性預(yù)適應(yīng)的作用[8-10]，針灸治療能夠激發(fā)人體自身正氣，達(dá)到“正氣存內(nèi)，邪不可干”的平衡狀態(tài)。現(xiàn)代研究認(rèn)為電刺激能夠促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化[11-12]。因此本課題選用電針內(nèi)關(guān)穴聯(lián)合BMSCs移植治療MIRI，以期闡明其對血管新生的作用機制。

利用BMSCs 的貼壁特性采用全骨髓貼壁法進(jìn)行細(xì)胞分離，該法操作簡便、容易掌握且提取的BMSCs 純度高、分化能力強，提取過程中保留了骨髓中其他的伴生細(xì)胞，最大程度地模擬了內(nèi)環(huán)境[13]。國際細(xì)胞治療協(xié)會制定BMSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn):①表達(dá)CD73、CD90和CD105而不表達(dá)CD34、CD45等;②貼壁生長，高度增殖分化；③在體外可以分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[14]。本實驗結(jié)果顯示BMSCs 增殖較為活躍，細(xì)胞生長曲線呈S形，細(xì)胞表面抗原顯示出BMSCs的特性，CD45陽性率<5%，CD90陽性率>90%，表明細(xì)胞純度較高、均一性良好。在急性心肌梗死(AMI)發(fā)生3～6 h后血清中CK-MB含量可迅速升高[15-16]，美國與歐洲心臟病協(xié)會同時強調(diào)AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)cTnI的升高尤其重要[17],梗死面積是評價心肌受損程度最直觀、最明確的指標(biāo)。本實驗主要通過建立MIRI大鼠模型，以血清中 CK-MB、cTnI的活性來評價心肌受損程度，以心肌梗死面積評價藥物治療效果，本實驗結(jié)果顯示，隨著時間的延長，各治療組均能夠降低大鼠心肌酶CK-MB、cTnI及心肌梗死面積水平，但是以電針+BMSCs組效果最顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HE染色具有觀察直觀的特點,HE染色后肌纖維、膠原纖維、細(xì)胞質(zhì)及紅細(xì)胞呈現(xiàn)深淺不一的紅色，細(xì)胞核著色為藍(lán)色；隨著治療時間的延長，各治療組細(xì)胞損傷逐漸修復(fù)，其中以電針+BMSCs組療效顯著，從病理形態(tài)學(xué)角度證實電針聯(lián)合BMSCs移植能夠減少炎性細(xì)胞浸潤，改善心肌纖維紊亂的狀態(tài)。熒光顯微鏡下觀察BMSCs組在心肌中呈現(xiàn)出良好的生長增殖狀態(tài)，隨著時間的延長BMSCs數(shù)目呈現(xiàn)遞增趨勢，電針+BMSCs組與之比較，效果更加明顯，說明在電針的誘導(dǎo)下BMSCs在心肌內(nèi)增殖狀態(tài)良好。微血管密度(MVD)能夠直觀反映側(cè)支循環(huán)建立情況和新生血管密度及數(shù)目，抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)是一種內(nèi)皮細(xì)胞連接分子,能夠特異性表達(dá)血管生成情況，采用免疫組化方法標(biāo)記抗體CD31能夠間接反映血管新生情況?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)在內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、梗死區(qū)域募集及血管新生等方面具有重要作用[18-20]。楊穎博等[21]臨床觀察急性冠脈綜合征患者血清中SDF-1水平明顯降低，這一趨勢與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，充分說明在心臟組織中SDF-1可提高心肌細(xì)胞活力，促進(jìn)血管新生，改善心功能。本實驗結(jié)果顯示：CD31、SDF-1經(jīng)過免疫組化染色后均呈“棕黃色或黃褐色”，即陽性表達(dá)，電針+BMSCs組治療效果明顯優(yōu)于其他治療組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在14 d時CD31呈現(xiàn)高表達(dá),說明經(jīng)過電針+BMSCs組治療后梗死區(qū)域微血管密度增加，間接反應(yīng)出毛細(xì)血管數(shù)量呈現(xiàn)持續(xù)增加，側(cè)支循環(huán)開始建立，逐步促進(jìn)血管新生。

綜上所述，電針聯(lián)合BMSCs移植對MIRI大鼠心肌具有保護(hù)作用，其機制可能與促進(jìn)BMSCs在心肌內(nèi)增殖、有效減少MIRI大鼠的心肌酶水平、減小心肌梗死面積、改善心肌病理改變、增加微血管密度和促進(jìn)血管新生有關(guān)。