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    掌葉大黃“柴禾”熏制加工過(guò)程中成分及體外抗氧化活性動(dòng)態(tài)變化

    2021-06-26 14:10:02馮銀平帖曉燕張?jiān)弃Q張文廣苗小樓李秀娟
    中成藥 2021年6期
    關(guān)鍵詞:熏制柴禾蒽醌

    馮銀平,帖曉燕,張?jiān)弃Q,王 丹,張文廣,苗小樓,李秀娟,李 蕓*

    (1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅 蘭州 730050;3.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050)

    掌葉大黃Rheum palmatum L.是《中國(guó)藥典》收載的正品大黃之一[1],主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、色原酮類、黃酮類、鞣質(zhì)類、多糖類等成分[2],其中蒽醌類是其重要的活性物質(zhì),也是現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》 規(guī)定控制大黃藥材質(zhì)量的指標(biāo),具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管、保肝、護(hù)肺、改善腦損傷、調(diào)節(jié)腸道菌群、治療腎纖維化等生物活性[3-5]。

    甘肅禮縣是掌葉大黃的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū),種植歷史悠久,但鮮品含水量較高,根莖粗大,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),水分不易散失,又因禮縣氣候潮濕陰冷,采收期處于秋冬季,易導(dǎo)致藥材霉?fàn)€、糠心、變色、變質(zhì),故采收后及時(shí)的干燥處理方式對(duì)保證藥材質(zhì)量和飲片臨床療效至關(guān)重要。大黃傳統(tǒng)干燥方法主要有熏干法、烘干法、陰干法等[6],但烘干法對(duì)設(shè)備要求高導(dǎo)致生產(chǎn)成本高,而陰干法歷時(shí)較長(zhǎng),易蟲蛀霉變,因而當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)普遍采用符合農(nóng)家生產(chǎn)加工模式的熏干法。歷代本草對(duì)大黃藥材干燥方法均有記載[7-9],宋平順等[10]發(fā)現(xiàn),柴禾熏制可使掌葉大黃蒽醌類成分含量升高,但關(guān)于柴禾熏制加工過(guò)程中化學(xué)成分和藥效的變化情況至今尚無(wú)報(bào)道。因此,本研究從以上2 個(gè)方面出發(fā),探討柴禾熏制不同階段掌葉大黃成分及體外抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,初步揭示藥材產(chǎn)地熏制加工機(jī)理。

    1 材料

    1.1 儀器與試劑 Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀、Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(美國(guó)Agilent 公司);BT125D 型電子天平、MA 37 型快速水分測(cè)定儀(德國(guó)賽多利斯公司);Milli-Q 超純水系統(tǒng)(德國(guó)默克生命科學(xué)公司);FW-400A 型高建萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司);DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);KQ-300VDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Multiskan GO 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

    蘆薈大黃素(批號(hào)CHB160628)、大黃素甲醚(批號(hào)CHB150817)、大黃酸(批號(hào)CHB160628)、大黃素(批號(hào) CHB150527)、大黃酚(批號(hào)CHB160914)對(duì)照品均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司,純度≥98%。色譜純甲醇、磷酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);維生素C(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)公司北京制藥廠);其他試劑均為分析純;水為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心分析測(cè)試一實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

    1.2 樣品 掌葉大黃藥材采自甘肅禮縣春天藥業(yè)有限公司同一種植基地,委托當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)產(chǎn)地柴禾熏制加工,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任中藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的根及根莖。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 熏制品制備 新鮮掌葉大黃采收后去掉支根,從中間切成兩半,置于屋內(nèi)棚上,使其切口向下,在棚下?tīng)t中點(diǎn)燃柴禾,不用明火,而用其煙熏制,直至完全熏干。根據(jù)熏制天數(shù)不同,分2 年共12批樣品,分別記為S1.1~S1.7(熏制0、10、15、30、40、60、120 d)及S2.1~S2.5(熏制0、60、100、140、180 d),其中樣品S2.5 為熏制140 d 后下架自然晾干而來(lái)。色譜圖見(jiàn)圖1。

    圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

    2.2 水分、浸出物測(cè)定

    2.2.1 水分 將樣品粉碎,混合均勻,四分法取樣,采用快速水分測(cè)定儀測(cè)定水分,平行3 次,取平均值,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    2.2.2 浸出物 取樣品(按干燥品計(jì))約2 g,精密稱定,按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部(通則2201)水溶性浸出物測(cè)定項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行浸出物測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    2.3 總蒽醌、游離蒽醌含量測(cè)定

    2.3.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[1],Agilent Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(85∶15);體積流量1 mL/min;柱溫40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量10 μL。

    2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量,加甲醇分別制備成質(zhì)量濃度為84、86、78、84、40 μg/mL 的溶液,各精密吸取2 mL,混勻,即得。

    2.3.3 總蒽醌供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)4 號(hào)篩)約0.15 g,精密稱定,參考文獻(xiàn)[1] 報(bào)道的方法處理,即得。

    2.3.4 游離蒽醌供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)4 號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,參考文獻(xiàn)[1]報(bào)道的方法處理,即得。

    2.3.5 樣品含量測(cè)定 取“2.3.2”下對(duì)照品溶液與“2.3.3”“2.3.4”下供試品溶液,在“2.3.1”項(xiàng)條件下測(cè)定,計(jì)算含量,色譜圖見(jiàn)圖1,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    2.4 DPPH 自由基清除率測(cè)定

    2.4.1 DPPH 貯備液制備 精密稱取DPPH 試劑2.0 mg,甲醇溶解定容至25 mL,即得(80 μg/mL),避光置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

    2.4.2 樣品貯備液制備 取各樣品粉末約0.5 g,精密稱定,精密加入60% 乙醇15 mL,超聲(300 W)提取30 min,抽濾,濾液旋干,殘?jiān)蛹状既芙猓?1],定容至100 mL,取1 mL,甲醇定容至10 mL,即得(500 μg/mL),放入4 ℃冰箱中冷藏,以配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。

    2.4.3 維生素C 對(duì)照液制備 取維生素C 適量,加甲醇溶解,制備成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的溶液,即得。

    2.4.4 自由基清除率測(cè)定 取上述溶液,分別稀釋成25、50、100、200、300、400、500 μg/mL 和5、10、20、40、60、80、100 μg/mL,在96 孔板上加入不同質(zhì)量濃度的樣品、DPPH 溶液各100 μL,室溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai、100 μL 甲醇與100 μL DPPH 溶液混合后吸光度Ao、100 μL 樣品溶液與100 μL 甲醇混合后吸光度Aj,平行3 次,取平均值,按公式[1-(Ai-Aj)/Ao] 計(jì)算清除率,同法處理維生素C 對(duì)照液,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 各樣品DPPH 自由基清除率與IC50值Fig.3 DPPH free radical scavenging rates and IC50 values of various samples

    2.4.5 IC50值計(jì)算運(yùn)用SPSS 19.0 軟件中的Probit 分析功能,以清除率為響應(yīng)頻率,觀測(cè)值匯總100%,質(zhì)量濃度為協(xié)變量,模型為L(zhǎng)ogit。

    2.5 相關(guān)性分析

    2.5.1 熏制天數(shù)與各指標(biāo) 以熏制天數(shù)為自變量,水分、浸出物、總蒽醌含量及抗氧化活性(IC50)為因變量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,熏制天數(shù)與水分、總蒽醌、IC50的相關(guān)系數(shù)分別為-0.906(P=0.000)、0.888(P=0.000)、-0.920(P=0.000),雙側(cè)P 均<0.01,提示熏制天數(shù)與水分呈負(fù)直線相關(guān),與總蒽醌含量和抗氧化活性呈正直線相關(guān);與浸出物的相關(guān)系數(shù)為0.631(P=0.028),雙側(cè)P<0.05,結(jié)合圖2 可認(rèn)為熏制天數(shù)與浸出物整體呈正相關(guān),隨著熏制天數(shù)的增加浸出物先呈上升趨勢(shì),在60 d 后逐漸趨于穩(wěn)定。

    2.5.2 抗氧化活性(IC50)與各指標(biāo) 以抗氧化活性(IC50)為自變量,水分、浸出物、總蒽醌含量為因變量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,IC50與水分、浸出物、總蒽醌的相關(guān)系數(shù)分別為0.961(P=0.000)、-0.751(P=0.005)、-0.766(P=0.004),雙側(cè)P 均<0.01,提示抗氧化活性與水分呈負(fù)相關(guān),與浸出物、總蒽醌含量呈正相關(guān)。

    2.5.3 其他指標(biāo) 水分與浸出物的相關(guān)系數(shù)為-0.753(P=0.005),與總蒽醌的相關(guān)系數(shù)為-0.811(P=0.001),雙側(cè)P 均<0.01,表明水分與浸出物、總蒽醌含量呈負(fù)相關(guān)。

    游離蒽醌含量與各項(xiàng)指標(biāo)之間均無(wú)相關(guān)性,結(jié)合t 檢驗(yàn)可知,隨著熏制天數(shù)增加,兩相鄰采樣點(diǎn)游離蒽醌含量變化顯著(P<0.05),整體呈近“M”型變化趨勢(shì),表明熏制過(guò)程中游離蒽醌變化復(fù)雜,但機(jī)制尚不明確。

    2.6 化學(xué)模式識(shí)別

    2.6.1 主成分分析 以12 批熏制不同天數(shù)樣品的水分、浸出物、總蒽醌、游離蒽醌、IC50值作為特征變量值,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析,以主成分得分及各變量載荷為依據(jù),結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知,第1 主成分的方差百分比為65.364%,第2 主成分的方差百分比為19.875%,累積方差百分比為85.239%,可以表征原始數(shù)據(jù)特征;12 批樣品聚為4 大類,從左至右分別為熏制120~140 d、熏制40~100 d、熏制15~30 d、熏制0 d,對(duì)應(yīng)藥材質(zhì)量為“最優(yōu)”“較好”“次之”“較差”,表明熏制不同天數(shù)藥材所含水分、浸出物、總蒽醌、游離蒽醌含量及抗氧化活性存在顯著差異,所建立的模型良好,可以對(duì)不同質(zhì)量藥材進(jìn)行有效區(qū)分。由圖5 可知,水分、浸出物、總蒽醌及IC50在第1 主成分中具有較大載荷,表明熏制天數(shù)影響水分、浸出物、總蒽醌含量及抗氧化活性,四者之間可能存在交互作用;第2 主成分與游離蒽醌密切相關(guān),表明掌葉大黃藥材經(jīng)熏制后游離蒽醌變化明顯。

    圖4 12 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for twelve batches of samples

    圖5 12 批樣品各變量載荷圖Fig.5 Variable load graph of twelve batches of samples

    2.6.2 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)在主成分分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行PLS-DA[12],獲得樣品分布散點(diǎn)圖,見(jiàn)圖6。由此可知,12 批樣品根據(jù)熏制天數(shù)被分為4 類,表明不同熏制天數(shù)下藥材差異顯著。

    圖6 各樣品OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.6 OPLS-DA score scatter plot for various samples

    12 批樣品PLS-DA 模型中各變量的VIP[13]見(jiàn)圖7,VIP 越大,表明該變量對(duì)于樣品分類的貢獻(xiàn)越大。由此可知,5 個(gè)變量對(duì)于差異性的影響程度依次為游離蒽醌>IC50>水分>總蒽醌>浸出物,均為重要變量(VIP>0.5),其中游離蒽醌的VIP>1.0,表明其變化是導(dǎo)致藥材質(zhì)量差異的重要因素。

    圖7 各樣品PLS-DA VIP 圖Fig.7 PLS-DA VIP plot of various samples

    3 討論

    自由基是單質(zhì)或化合物均裂產(chǎn)生的帶有未成對(duì)電子的原子或基團(tuán),研究發(fā)現(xiàn)其與心血管疾病(CVD)、惡性腫瘤、2 型糖尿病、感染機(jī)制、纖維形成和神經(jīng)紊亂等多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),大黃提取物的抗氧化活性與蒽醌類成分有一定的相關(guān)性[16]。課題組前期以大黃加工品的折干率、蒽醌衍生物含量及橫切面質(zhì)地和色澤變化為指標(biāo),比較了曬干法、陰干法、微波法、不同溫度烘干和傳統(tǒng)柴火熏制等不同干燥方式,結(jié)果顯示不同干燥方式以熏干法的蒽醌類成分含量、橫切面色澤質(zhì)量最好[17]。

    熏干法的具體操作參考文獻(xiàn)[18],本研究結(jié)果表明,掌葉大黃藥材在熏制過(guò)程中化學(xué)成分和體外抗氧化活性發(fā)生顯著變化。隨著熏制天數(shù)增加,水分降至安全范圍,浸出物和抗氧化活性先增加后趨于穩(wěn)定,總蒽醌含量呈“單項(xiàng)遞增”模式,游離蒽醌“先增后減,再增再減”,即近“M”型變化模式。蒽醌類成分所呈現(xiàn)的變化模式在其飲片炮制過(guò)程中也有類似表現(xiàn),楊麗等[19]在研究大黃炭加熱過(guò)程顏色特征與14 種成分含量變化關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度升高,游離蒽醌呈“先增后減”變化趨勢(shì),并推測(cè)導(dǎo)致該變化的原因可能是溫度升高導(dǎo)致結(jié)合蒽醌苷鍵斷裂形成游離蒽醌,而加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后又使得游離蒽醌結(jié)構(gòu)被破壞,游離蒽醌的羰基先降解由苯醌轉(zhuǎn)化成萘醌,再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成醛或酮;另外有關(guān)大黃發(fā)酵使結(jié)合蒽醌轉(zhuǎn)化為游離蒽醌的研究報(bào)道較為常見(jiàn)[20],而綜合炒炭、發(fā)酵等炮制方法發(fā)現(xiàn)均與發(fā)熱現(xiàn)象或微生物的參與有關(guān),推測(cè)大黃藥材采收之后,在一定含水量、適宜溫度、相關(guān)微生物酶的參與下,其次生代謝產(chǎn)物蒽醌類成分的轉(zhuǎn)化和積累仍十分活躍,故總蒽醌含量呈“單項(xiàng)遞增”模式,而游離蒽醌的變化較為復(fù)雜。課題組將在后期進(jìn)行相關(guān)微生物酶方面的研究,以期明確其變化機(jī)理,為進(jìn)一步闡明熏制加工機(jī)制和規(guī)范產(chǎn)地加工技術(shù)提供參考。

    致謝:衷心感謝甘肅禮縣春天藥業(yè)有限公司、蘭州大學(xué)胡芳弟教授、甘肅省中醫(yī)院閆治攀主管中藥師以及課題組成員馬冬妮、楊秀娟、石琪奇等對(duì)本研究提供的指導(dǎo)和幫助。

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