長鏈非編碼RNA CTC-459F4.3異常表達對肝癌上皮-間質轉化的影響*

王 波 金 雯 楊 梅 王躍華

(1銅陵職業(yè)技術學院醫(yī)學護理系；2銅陵市人民醫(yī)院腫瘤科 安徽銅陵 244061)

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞向間質細胞轉化的生物學行為，在此過程中，惡性腫瘤細胞可突破基底膜、入侵血液及淋巴循環(huán)從而完成侵襲、轉移的目的，而遠處轉移是影響肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)預后的關鍵因素之一。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，Lnc RNA)并不具備編碼蛋白質的能力，一度被認為“毫無價值”。但越來越多的研究表明[1-3]，Lnc RNA在HCC的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，如參與細胞周期調節(jié)、調控上下游信號轉導、影響腫瘤耐藥、促進腫瘤微血管生成等。Lnc RNA家族龐大，CTC-459F4.3是新近發(fā)現的成員，相關報道較為鮮見。因此基于微環(huán)境針對CTC-459F4.3開展HCC早期事件的研究有助于豐富人類對Lnc RNA的進一步認知。該研究旨在觀察CTC-459F4.3表達下調對HCC侵襲、遷移的影響，探討CTC-459F4.3在HCC中對上皮-間質轉化的作用，以期為HCC早期診治的臨床決策提供新思路。

1材料與方法

1.1材料來源

SMMC-7721細胞培養(yǎng)于ATCC細胞庫。

1.2主要試劑與儀器

CTC-459F4.3 shRNA慢病毒質粒(上海吉凱)；DMEM(Gibco，C11995500CP)；RPMI 1640(Gibco，C11875500BT)；胎牛血清(Bio IND，04-002-1A)；Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112)；PBS，pH7.4(Gibco，10010-023)；Trypsin-EDTA(0.05%)(Lifetechnologies，25300-054)；牛血清白蛋白(Lifetechnologies，15561012)； 細胞培養(yǎng)皿：Coning，430167；細胞培養(yǎng)板：Costar，3524；75cm2細胞培養(yǎng)瓶：Corning，43063；Transwell小室 ：Corning，3422 (8μm孔徑)；酶標儀：BioTek，EPOCH等。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)與轉染 10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃CO2培養(yǎng)箱中，5%CO2，相對濕度90%。用0.125%胰蛋白酶37℃條件下作用3～5 min。培養(yǎng)基輕洗1次，去除死亡細胞的碎片及殘余胰酶。加入DMEM / RPMI 1640完全培養(yǎng)基5mL，反復吹打，制成細胞懸液，接種于25mL培養(yǎng)瓶中，1:2分瓶培養(yǎng)。于對數期接種于6孔板中，一定滴度的慢病毒滴入每孔轉染細胞，48h后收集細胞。分別設CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組，采用RT-PCR方法檢測轉染效率。

1.3.2RT-PCR檢測CTC-459F4.3轉染效率 細胞懸液加入600μL Buffer RL，反復吹打使其充分裂解、mRNA完全分離；離心后，收集RNA溶液，采用分光光度計定量，估算提取總量10ug，超低溫保存。按照cDNA合成說明書配置反應體系；依據定量PCR試劑盒說明進行擴增實驗。50℃，2min；95℃，10min；40循環(huán)；95℃，15S，60℃，60S。收集數據，采用2-ΔΔCt法計算RT-PCR結果相對表達量。

表1 引物序列表

1.3.3 Western-Blot檢測 配制12%分離膠和4%濃縮膠；SDS-PAGE 電泳1.5h，電流為濃縮膠25mA，分離膠30mA 。轉膜400mA轉移0.5h、1% BSA對膜進行封閉40min；一抗4℃孵育過夜；二抗孵育37℃孵育1h；PBS清洗3次后，按照試劑盒說明書配制ECL顯色工作液、熒光拍照，凝膠圖像系統分析光密度值。

1.3.4Transwell侵襲、遷移試驗 接種前將24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5min濕潤；用胰蛋白酶消化細胞后，1% FBS的培養(yǎng)基重懸細胞，調整密度1×105細胞/mL，接種到Transwell小室內，每個小室分別加0.2mL各組細胞懸液，下層加入0.8mL含10% FBS的完全培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；培養(yǎng)12h后，每孔加入1mL4%多聚甲醛溶液，室溫固定15min；吸去固定液，用1×PBS洗滌2次，每孔加入1mL 0.5%結晶紫溶液，染色60min后用1×PBS洗3次，晾干；用棉簽小心擦去Transwell小室上部內沒有遷移的細胞，置于顯微鏡下觀察。

1.4統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析實驗結果，計量資料采用均數±標準差表示，組間采用方差分析，以p<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1CTC-459F4.3 shRNA轉染效率

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組CTC-459F 4.3 mRNA表達量分別為：0.376±0.0399；0.746±0.492；0.752±0.269；組間比較發(fā)現，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質粒組比較均有統計學意義(F=88.368，p<0.001)；兩組差異無統計學意義(p=0.867)。詳見圖1。

圖1 CTC-459F4.3 shRNA慢病毒質粒轉染效率

2.2Western-Blot檢測結果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組E-cadherin表達量分別為：1.040±0.070；1.334±0.293；1.320±0.162；組間比較發(fā)現，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質粒組比較均有統計學意義(F=40.994，p<0.001)；對照組與空質粒組比較差異無統計學意義(p=0.728)。CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組N-cadherin表達量分別為：1.515±0.162；1.387±0.033；1.393±0.176；組間比較發(fā)現，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質粒組比較均有統計學意義(F=28.138，p=0.001)；對照組與空質粒組比較差異無統計學意義(p=0.778)。詳見圖1。

圖2 三組Western-Blot檢測結果

2.3Transwell侵襲檢測結果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組穿透下室細胞數分別為：137.667±5.686個；51±2.0個；47±2.0個。組間比較發(fā)現，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質粒組比較均有統計學意義(F=585.653，p<0.001)；對照組與空質粒組比較差異無統計學意義(p=0.230)。見圖3。

圖3 三組Transwell侵襲檢測結果

2.4Transwell遷移檢測結果

CTC-459F4.3敲低組、對照組、空質粒組遷移細胞數分別為：132.67±2.082個；43.33±2.517個；45.33±2.082個。組間比較發(fā)現，CTC-459F4.3敲低組與對照組和空質粒組比較均有統計學意義(F=1561.156，p<0.001)；對照組與空質粒組比較差異無統計學意義(p=0.315)。詳見圖4。

圖4 三組Transwell遷移檢測結果

3討論

HCC作為常見的消化系統惡性腫瘤之一，其診斷和治療一直以來備受學者們的矚目。早期切除雖是最有效的手段之一，但總體生存率仍不理想。Lnc RNA家族被發(fā)現在表觀遺傳學、轉錄水平及轉錄后蛋白修飾介導某些信號基因的表達，以致惡性腫瘤細胞產生相應的生物學行為。EMT是細胞的上皮屬性減弱或缺失并部分或全部獲得間質特性的現象，此過程可使細胞粘附能力減弱而伴隨運動能力的增強。因此，EMT被認為是惡性腫瘤包括HCC轉移、擴散的關鍵環(huán)節(jié)，眾多研究發(fā)現Lnc RNA可以發(fā)揮癌基因作用參與EMT的進程。

隨著高通量檢測技術的進步，學者們已經發(fā)現了至少3萬余個Lnc RNA在各類疾病中表達失調[4]。部分Lnc RNA被發(fā)現起到促進EMT的作用，lncRNA-n335586在HCC中高表達可通過調控miR-924/CKMT1A信號軸來實現正向促進肝癌細胞遷移，侵襲和EMT及體內轉移[5]。lncRNA-HOTAIR是學者們研究較多的Lnc RNA之一，HOTAIR高表達，可通過介導miR-23b-3p-Zeb-1通路增強EMT，促進HCC細胞的侵襲、遷移，而Zeb信號基因可以與E-cadherin編碼的CDH1啟動子E2位點結合實現對EMT的影響[6]。HOTAIR可以調控信號蛋白如：阿片類生長因子受體(opioid growth factor receptor，OGFr)的表達，敲低HOTAIR可調節(jié)OGFr過表達從而抑制了HCC細胞的轉移[7]。此外，還有不少Lnc RNA對EMT進程有正向效應[8-10]。Lnc RNA家族中也有不少對EMT起抑制作用，lncRNA-CASC2可以通過miR-367-FBXW7信號軸的調控， 逆轉上皮表型向間質表型轉化，其機制與lncRNA-CASC2高表達上調FBXW7有關。CADM1-AS1低表達與HCC晚期分期、早期轉移和低生存率相關，其過表達可抑制HCC增殖、侵襲和轉移，并通過對PTEN/AKT/GSK-3β信號通路及細胞周期的調控誘導HCC細胞停滯于G0/G1期，發(fā)揮其抑癌基因作用[12]。CTC-459F4.3是新近報道的lncRNA，張軍等研究顯示，CTC-459F4.3基因過表達能夠抑制HCC的增殖和遷移[13]，而針對該基因的研究，目前尚不多見。

E-cadherin表達下調，N-cadherin上調是EMT的特征之一。Western-Blot檢測發(fā)現，與對照組和空質粒組比較，CTC-459F4.3基因敲除組E-cadherin表達下調，N-cadherin上調，差異有統計學意義(p<0.05)，提示CTC-459F4.3基因敲除后可以促進EMT。Transwell侵襲試驗結果顯示CTC-459F4.3基因敲除組肝癌細胞侵襲數量多于對照組和空質粒組差異有統計學意義(p<0.05)；Transwell遷移試驗結果顯示CTC-459F4.3基因敲除組肝癌細胞遷移數量多于對照組和空質粒組差異有統計學意義(p<0.05)。上述結果提示CTC-459F4.3基因敲除后能夠增強HCC的侵襲和遷移能力，促進EMT進程。

綜上，該研究發(fā)現，CTC-459F4.3可通過調控E-cadherin和N-cadherin的表達，發(fā)揮其抑癌基因的作用，CTC-459F4.3敲除后可以促進HCC的EMT進程。須要指出的是，有關Lnc RNA CTC-459F4.3的研究并不多見，其參與HCC侵襲、遷移的機制尚不清楚。課題組將深入探究CTC-459F4.3與HCC發(fā)展分子機制的關系，為完善Lnc RNA基因診斷提供理論依據。