球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發(fā)酵生產(chǎn)抗氧化多糖

王子朝，郭佳源，郜文碩，崔靜雯，楊青青，朱金帆，張慧茹

1(河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州，450001)2(河南工業(yè)大學 國際教育學院，河南 鄭州，450001)

我國是小麥種植與消費大國，小麥秸稈作為小麥種植的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量高達15 334萬t。但小麥秸稈分布零散、體積大、運輸成本高以及綜合利用經(jīng)濟性差、產(chǎn)業(yè)化程度低等缺點，導致大量小麥秸稈未被有效利用，不僅造成資源浪費，還帶來很多安全隱患和環(huán)境污染[1]。小麥秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是一種產(chǎn)量巨大的木質(zhì)纖維素資源[2]。由于木質(zhì)素和半纖維素之間以牢固的醚鍵或酯鍵相互交聯(lián)并鑲嵌在纖維素內(nèi)，且木質(zhì)素包裹在纖維素外形成一種外圍基質(zhì)，使得木質(zhì)纖維素產(chǎn)品的直接利用變得異常困難，限制了小麥秸稈的利用[3]。因此，有效開發(fā)利用小麥秸稈資源已成為提高麥田經(jīng)濟效益和綠色可持續(xù)發(fā)展的途徑之一。

本實驗以小麥秸稈為唯一碳源接種球毛殼菌CGMCC 6882進行發(fā)酵，并對發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖進行提取純化、結(jié)構(gòu)解析和抗氧化活性分析，探究球毛殼菌CGMCC 6882對小麥秸稈的利用情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小麥秸稈，河南鄭州郊區(qū)；單糖標準品，美國Sigma公司；瓊脂、蛋白胨、三氟乙酸、苯酚、濃硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；胰酶消化液、青霉素、鏈霉素、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HD500MHZ核磁共振儀，德國Bruker公司；Waters 1525高效液相排阻色譜儀，美國Waters公司；HT7700透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司；WQF-510紅外光譜儀，天津天光光學儀器有限公司；Q50 熱重分析儀，美國TA公司；Series 8000 WJCO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發(fā)酵生產(chǎn)活性多糖

1.3.1.1 球毛殼菌CGMCC 6882菌種活化

采用馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂制備PDA培養(yǎng)基，然后將冰箱中保藏的球毛殼菌CGMCC 6882取出并接種于PDA平板上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右。

1.3.1.2 球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發(fā)酵

將小麥秸稈烘干、粉碎、過60目篩，并以其作為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按2%接種量接種球毛殼菌CGMCC 6882種子液，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.1.3 發(fā)酵液的收集與處理

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液抽濾除菌體和大顆粒不溶性雜質(zhì)，25 ℃、10 000 r/min離心20 min除去不溶性細小顆粒，收集上清液并在60 ℃、0.1 MPa下旋蒸濃縮。濃縮液中加入活性炭于25 ℃、150 r/min振蕩過夜并離心取上清液。上清液中加入3倍體積Sevage溶劑脫蛋白，然后加入4倍體積無水乙醇4 ℃過夜析出多糖。最后，將多糖凍干并研磨收集。

1.3.1.4 發(fā)酵過程中多糖含量的測定

以不接種球毛殼菌CGMCC 6882的發(fā)酵培養(yǎng)基作空白對照，分別在不同時間用吸管吸取2 mL空白對照組和實驗組發(fā)酵液。加5倍無水乙醇析出多糖沉淀，再加蒸餾水復(fù)溶，并定容到50 mL。然后采用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖含量[4]。

1.3.2 多糖結(jié)構(gòu)特征分析

采用高效體積排阻色譜測定多糖分子質(zhì)量，色譜條件為：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm二級串聯(lián)柱，流動相0.1 mol/L硝酸鈉，流速0.9 mol/min，柱溫45 ℃。用Mw(重均分子質(zhì)量) 分別為270 000、975 000、3 680 000、13 535 000 Da的葡聚糖標品繪制分子質(zhì)量校正曲線。

使用高效離子色譜測定單糖組成，色譜條件：Dionex CarboPacPA20 (3 mm×150 mm) 陰離子交換柱，Dionex CarboPacPA20 (3 mm×50 mm) 保護柱，以18 mmol/L NaOH溶液為流動相，等度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，脈沖安培檢測器檢測，進樣體積為20 μL。

稱取1.0 mg球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖，然后與200 mg溴化鉀充分研磨并壓片，采用紅外光譜儀于400～4 000 cm-1對樣品進行紅外掃描，并用OMNIC 8.2軟件處理紅外數(shù)據(jù)。

稱取球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖約3 mg，以1 mL重水溶液進行溶解，放置室溫下過夜使多糖完全溶解，渦旋混勻，以7 200 r/min離心10 min，最后將樣品轉(zhuǎn)移到5 mm核磁管中進行檢測。核磁檢測條件如下：PA BBI 400S1 H-BB-D-05 Z探頭，共振頻率500 MHz，儀器檢測溫度298 K。以四甲基硅烷(δ= 0 ppm)和重水(D2O)(δ= 4.8 ppm) 作化學位移內(nèi)標。

稱取球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖1 mg加入到100 mL水中，室溫下150 r/min磁力攪拌過夜，然后將多糖溶液滴到銅網(wǎng)上，晾干后采用透射電子顯微鏡進行掃描觀察，根據(jù)觀察要求放大不同倍數(shù)。

稱取3 mg左右球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖，使用Al2O3作參比物，在0.15 MPa的N2氣氛下從35 ℃升溫至300 ℃進行熱重分析，升溫速率10 ℃/min。

1.3.3 多糖的體外抗氧化活性

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖清除ABTS陽離子自由基、超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的活性參照HU等[5]方法進行檢測。

1.3.4 多糖的細胞抗氧化活性

1.3.4.1 細胞氧化損傷誘導模型的構(gòu)建

將Caco-2細胞活化接種于96孔板，移入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后每孔加入100 μL含不同H2O2濃度的細胞培養(yǎng)液，對Caco-2細胞進行誘導損傷。采用MTT染色法在490 nm處測定各組吸光值。

1.3.4.2 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的細胞抗氧化活性

細胞損傷會導致其清除H2O2能力下降，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，過氧化物MDA 大量聚集。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化酶系的重要組成部分，通過測定加入不同濃度多糖溶液的細胞氧化誘導Caco-2細胞損傷模型胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力變化，分析球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對細胞的氧化保護作用[6]。

將接種了Caco-2細胞的96孔細胞培養(yǎng)板移入細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)穩(wěn)定。然后，多糖試驗組每孔加入100 μL含IC50左右值濃度的H2O2和不同濃度CGMCC 6882胞外多糖的培養(yǎng)液。試驗設(shè)置空白組 (不加H2O2和CGMCC 6882胞外多糖) 和H2O2對照組 (不加CGMCC 6882胞外多糖，只加培養(yǎng)液和400 μmol/L的H2O2溶液)。最后，將上述5組細胞均置于細胞培養(yǎng)箱中，在37 ℃和含5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)4 h。之后每孔加入100 μL細胞裂解液使細胞裂解，然后于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液作為樣本，參照試劑盒說明書對Caco-2胞內(nèi)的SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 球毛殼菌 CGMCC 6882利用小麥秸稈發(fā)酵生產(chǎn)活性多糖

以小麥秸稈為唯一碳源配制平板培養(yǎng)基，并接種球毛殼菌CGMCC 6882，發(fā)現(xiàn)平板上長出白色菌落 (圖1-a)，證明其具有降解利用小麥秸稈的能力。將球毛殼菌CGMCC 6882接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，對其發(fā)酵液進行抽濾除菌、離心、濃縮、脫色、脫蛋白、醇沉、柱層析和冷凍干燥等處理獲得胞外多糖(圖1-b)。對發(fā)酵過程中多糖產(chǎn)量進行監(jiān)測(圖1-c)，空白對照組在培養(yǎng)過程中幾乎沒有多糖產(chǎn)生，說明發(fā)酵液中多糖是由球毛殼菌CGMCC 6882所產(chǎn)生。同時，XIANG等[7]發(fā)現(xiàn)Inonotusobliquus可以利用玉米秸稈生產(chǎn)抗氧化性多糖；XU等[8]也證實I.obliquus可以分別利用小麥秸稈、水稻秸稈和甘蔗渣發(fā)酵生產(chǎn)抗氧化活性胞外多糖。

a-球毛殼菌CGMCC 6882生長情況;b-球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖；c-發(fā)酵液中多糖含量圖1 球毛殼菌CGMCC 6882在小麥秸稈平板上生長情況、胞外多糖生成情況及發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量Fig.1 Growth profile of C.globosum CGMCC 6882 on wheat straw plate, polysaccharide produced, the content of polysaccharide in fermentation broth

2.2 多糖結(jié)構(gòu)特征解析

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的單糖組成為鼠李糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖和葡萄糖醛酸，且其摩爾比為21.46∶1.58∶1.11∶55.15∶36.37∶7.04∶7.34 (圖2-a)。同時，高效液相排阻色譜檢測結(jié)果顯示(圖2-b)，球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的Mn(數(shù)均分子質(zhì)量)為3.391×104Da，Mw為3.538×104Da，分散系數(shù)為1.043。LIU等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單糖組成中葡萄糖酸和海藻糖含量影響Pleurotuscitrinipileatus多糖的抗氧化活性。SONG等[10]發(fā)現(xiàn)糖苷鍵類型和巖藻糖含量能夠影響平菇多糖的抗氧化活性。但LI等[11]證實，木糖含量對EpimediumkoreanumNakai多糖的抗氧化活性影響不大。大量研究發(fā)現(xiàn)，多糖的分子質(zhì)量與其活性之間存在密切聯(lián)系[12]。BLASCHEK等[13]發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量可以影響多糖的生物活性，高分子質(zhì)量葡聚糖具有較好免疫調(diào)節(jié)活性。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)Pleurotustuber-regium多糖分子質(zhì)量影響其抗腫瘤活性。WANG等[15]研究也證實，小分子質(zhì)量多糖具有更好的抗癌活性。單糖組成及比例和分子質(zhì)量大小會影響多糖及寡糖的生物活性，可使多糖具有不同生物活性。

a-離子色譜；b-排阻色譜圖2 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖色譜圖Fig.2 Chromatography of exopolysaccharide from C.globosum CGMCC 6882

CGMCC 6882胞外多糖在水溶液中形成米粒狀小顆粒，而非網(wǎng)狀或交聯(lián)狀，說明這一胞外多糖的分子質(zhì)量可能較小。SHEN等[18]在研究Nostocflagelliforme多糖的理化特性和抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)，多糖的空間結(jié)構(gòu)也會影響其生物活性，尤其是抗氧化活性。熱重分析結(jié)果顯示(圖4)，CGMCC 6882胞外多糖在整個加熱過程中有2個降解階段，第1個降解階段出現(xiàn)在100 ℃左右，主要是由于多糖結(jié)合水受熱揮發(fā)導致質(zhì)量減少，第2個降解階段開始于200 ℃左右，主要是由于多糖主鏈及氫鍵斷裂，生成CO2和水導致的失重降解[19]。

圖4 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的熱重分析結(jié)果Fig.4 Thermogravimetric analysis results of polysaccharide produced by C. globosum CGMCC 6882

2.3 多糖的體外抗氧化活性

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖可以有效清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子和ABTS陽離子自由基，且清除率與多糖濃度成正相關(guān) (圖5)。當多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，對上述自由基的清除率分別為(83.08±2.58)%、(81.39±1.47)%、(79.38±2.03)%和(85.69±1.62)%。大量實驗證明自由基會干擾機體正常的新陳代謝，引起DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子的氧化損傷，進而誘發(fā)心血管疾病、糖尿病等多種疾病[20]。王浩南等[21]發(fā)現(xiàn)丹參花多糖不僅具有較強抗氧化活性，同時還具有保護神經(jīng)細胞、抑制黑色素生成和保肝等作用。球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖可以有效清除體內(nèi)自由基，有延緩衰老和保護機體的作用，有望在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

a-DPPH自由基;b-羥自由基;c-超氧陰離子;d-ABTS陽離子自由基圖5 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacity of polysaccharide produced by C.globosum CGMCC 6882

2.4 多糖的細胞抗氧化

當H2O2濃度增加到400 μmol/L時，細胞活性下降到(51.2±1.5)%，適于構(gòu)建細胞氧化損傷模型 (圖6)。因此，選擇400 μmol/L的H2O2誘導構(gòu)建Caco-2細胞氧化損傷模型。細胞抗氧化模型分析發(fā)現(xiàn)(圖7)，H2O2組MDA活力顯著升高，SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著下降，說明H2O2對Caco-2細胞造成了氧化損傷。多糖實驗組中MDA酶活水平從(15.8±0.25) μmol/g降低至(7.5±0.31) μmol/g，且MDA酶活水平與球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖濃度成負相關(guān)。同時，多糖實驗組細胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px活力水平明顯升高，分別從(147.28±4.82)、(11±1.15)和(18.08±1.96) U/mg增加至(238.89±3.91)、(39.12±0.76)和(41.35±2.18) U/mg，且與球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖濃度成正相關(guān)。上述結(jié)果表明，球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對被H2O2氧化損傷的Caco-2細胞有很好的保護作用[22]。同時，吳麗紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，川牛膝多糖對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷具有一定保護作用；顧程遠等[24]研究也證實，桔梗多糖對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷也有一定保護作用。這些實驗中的多糖與本實驗所獲得的球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖具有相似的抗氧化作用。

圖6 不同濃度H2O2對細胞存活率的影響Fig.6 Effect of different concentrations H2O2 on the cell viability of Caco-2 cells

圖7 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對Caco-2胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力的影響Fig.7 Effect of polysaccharide produced by C.globosum CGMCC 6882 on the SOD, CAT, GSH-Px, and MDA activities in Caco-2 cells

3 結(jié)論

小麥秸稈的隨意丟棄和堆放，不僅造成資源浪費，還帶來很多安全隱患和環(huán)境污染等問題。本實驗以小麥秸稈為唯一碳源，采用球毛殼菌CGMCC 6882進行發(fā)酵獲得了一種具有良好抗氧化性的胞外多糖。在未來的研究中，我們將采用代謝途徑分子改造、小麥秸稈預(yù)處理和發(fā)酵工藝優(yōu)化等策略，實現(xiàn)球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈工業(yè)化生產(chǎn)活性胞外多糖。