葡萄酒中揮發(fā)性硫化物及其分析方法的研究進(jìn)展

譚鳳玲，褚瑞超，司夢雅，王寶石，張明霞

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南 新鄉(xiāng)，453003)

揮發(fā)性硫化物(volatile sulfur compounds，VSCs)是一類小有機(jī)分子，在食品和飲料香氣中起著重要作用。它們可以與不同風(fēng)味相互作用，并增加香氣的復(fù)雜性，構(gòu)成包括葡萄酒在內(nèi)的許多食品的品質(zhì)與獨特性[1-2]。但VSCs具有很低的感官閾值和強(qiáng)烈的異味，大多數(shù)都被認(rèn)為具有負(fù)面影響[3]。

葡萄酒中VSCs主要來源于釀酒過程中微生物代謝以及化學(xué)作用。葡萄園中含硫農(nóng)藥的使用、初始葡萄汁中微生物群落、葡萄汁化學(xué)成分、酵母類型、發(fā)酵條件以及裝瓶和貯存方式等均會影響葡萄酒中VSCs數(shù)量和類型[4-5]。葡萄酒中現(xiàn)已報道的VSCs有40多種，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上可分為硫醇、硫醚、多硫化物、硫酯和含硫雜環(huán)化合物5大類[6]。硫化氫、甲硫醇、乙硫醇等低級硫醇具有強(qiáng)揮發(fā)性、高活性和低閾值的特點，對葡萄酒的呈香、呈色以及口味都有顯著影響，被認(rèn)為是形成還原味(臭雞蛋味、臭鼬氣味、大蒜味及洋蔥味)的主要來源物質(zhì)，對存在還原性缺陷的葡萄酒起決定性作用，常被稱為異味物質(zhì)。另一方面，部分VSCs在一定濃度下對香氣產(chǎn)生積極影響，如白葡萄酒中硫醇3-巰基己醇和紅葡萄酒中二甲基硫醚，能夠賦予葡萄酒圓潤的口感，散發(fā)出果香與花香的香味，提高葡萄酒的感官體驗[1]。因此，對葡萄酒中VSCs的定性及定量的檢測分析具有重要的意義。

由于VSCs在葡萄酒中含量低，檢測閾值低，葡萄酒中VSCs的檢測困難，常規(guī)檢測方法對于VSCs的檢測具有局限性，不能準(zhǔn)確地對其進(jìn)行定性定量分析。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的進(jìn)步，色譜儀以及質(zhì)譜儀的普遍應(yīng)用，VSCs檢測水平取得了長足的進(jìn)步，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、高效。GC-MS[7]以及HPLC-MS/MS[8]逐漸應(yīng)用到葡萄酒VSCs的檢測。

1 揮發(fā)性硫化物的來源

葡萄酒中VSCs可以在葡萄酒釀造及其貯存期間的各個階段形成，通常為ng/L～μg/L，具有非常低的閾值。葡萄酒的品種香氣物質(zhì)硫醇包括4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮、3-巰基己醇、3-巰基己醇乙酸酯等芳香化合物，是由酵母分泌的C—S裂解酶催化，從半胱氨酸和谷胱甘肽結(jié)合的前體中釋放[9]，主要存在于長相思、霞多麗、雷司令、賽美容、施埃博、瓊瑤漿、赤霞珠和美樂等品種的葡萄酒中，賦予葡萄酒特征香氣。硫化氫、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醚等一些低分子含硫化合物會產(chǎn)生異味，尤其是在高濃度下，對葡萄酒品質(zhì)會產(chǎn)生負(fù)面影響。表1總結(jié)了葡萄酒中一些常見VSCs的感官閾值及香氣特征。

表1 葡萄酒中常見VSCs的感官閾值及香氣特征[10-11]Table 1 Sensory thresholds and aroma characteristics of VSCs in wine[10-11]

1.1 硫化氫

葡萄酒中H2S主要來源于葡萄果實和葡萄酒發(fā)酵過程添加的SO2。葡萄從栽培到成熟所使用的農(nóng)藥大多為含硫物質(zhì)，在酸性介質(zhì)中，農(nóng)藥中金屬離子表面會產(chǎn)生氫原子，氫原子具有強(qiáng)烈的還原性，利于H2S的產(chǎn)生。同時，由于SO2具有抗氧化和抗菌特性，能夠降低葡萄酒染菌機(jī)率，保證葡萄酒色澤，長期以來在葡萄酒的釀造過程中廣泛使用，SO2形成的硫酸根可以被還原成H2S[12]。

釀酒酵母硫代謝過程也是產(chǎn)生H2S的重要途徑，酵母能夠通過硫酸鹽同化途徑或通過半胱氨酸和谷胱甘肽的分解代謝產(chǎn)生H2S。同時，此過程往往還會受到果汁澄清度和必需營養(yǎng)素等因素的影響[13]。

1.2 硫醇及含硫雜醇油

釀酒酵母能夠?qū)⑵咸丫浦写嬖诘姆菗]發(fā)性硫前體轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的、具有風(fēng)味活性的硫醇化合物。甲硫醇、乙硫醇、3-甲硫基醇、3-甲硫基丙醛，3-甲硫基-戊酸等硫醇和含硫雜醇油由酵母在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化前體甲硫氨酸而獲得[14]。甲硫醇可由甲硫氨酸轉(zhuǎn)氨作用生成4-甲硫基-2-丁酮酸，之后再經(jīng)裂解生成，也可通過γ-裂解酶直接脫氨基生成。而3-甲硫基丙醛則可通過4-甲硫基-2-丁酮酸的脫羧產(chǎn)生，生成的3-甲硫基丙醛再經(jīng)脫氫酶催化反應(yīng)生成3-甲硫基丙醇。但3-甲硫基丙醛僅在發(fā)酵結(jié)束后才能檢測到，其含量在陳釀過程中會增加，進(jìn)一步反應(yīng)會生成令人不愉快氣味的3-甲硫基丙酯(大蒜味)[15]。硫醇亦可通過半胱氨酸及谷胱甘肽作為前體物質(zhì)的降解產(chǎn)生，如4-甲硫基丁醇和2-巰基乙醇，但生成途徑尚不清晰。

1.3 硫醚

葡萄酒中生成硫醚的原因有多種，葡萄汁發(fā)酵時酵母活性、發(fā)酵條件、發(fā)酵液營養(yǎng)條件都會影響硫醚的產(chǎn)生。葡萄汁中含硫氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的代謝，以及酵母產(chǎn)生自溶等也可導(dǎo)致硫醚產(chǎn)生，但更多的研究表明[16-17]，葡萄酒中大部分硫醚是在裝瓶后的陳釀期間，由硫醇進(jìn)一步氧化得到，如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚由甲硫醇進(jìn)一步氧化生成，對葡萄酒的氣味具有不良影響。

1.4 硫醇酯及含硫雜環(huán)化合物

含硫雜環(huán)化合物會伴隨半胱氨酸代謝而形成含硫的五環(huán)、六環(huán)及稠環(huán)化合物[18]，能夠賦予葡萄酒特殊的烘烤味。2-甲硫基呋喃硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇及其二硫代物能夠使葡萄酒具有炭燒咖啡、烤面包以及烤肉味。甲硫醇和乙硫醇與氨基酸、游離脂肪酸或糖代謝中產(chǎn)生的乙酰輔酶A經(jīng)酯化酶催化反應(yīng)生成硫代乙酸酯類物質(zhì)；硫代乙酸脂類物質(zhì)的增加速度與 H2S 生成速度相關(guān)，在發(fā)酵初期硫代乙酸甲酯含量升高，而發(fā)酵后期硫代乙酸乙酯含量升高[19]。

1.5 揮發(fā)性硫化物的相互作用與轉(zhuǎn)化途徑

研究證實H2S在高濃度下與酒中乙醛或乙醇發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生乙硫醇，乙硫醇可以二聚生成二乙基二硫化合物以及乙酸乙酯[20]。KINZURIK等[1]通過添加外源VSCs(H2S、乙硫醇、乙酸乙酯、甲硫醇和硫代乙酸甲酯)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)從H2S轉(zhuǎn)化為乙硫醇以及從乙硫醇、甲硫醇到乙酸乙酯的轉(zhuǎn)化依賴活酵母細(xì)胞催化。然而，硫代乙酸甲酯到甲硫醇和從乙酸乙酯到乙硫醇的反應(yīng)主要依靠化學(xué)降解。進(jìn)一步地， KINZURIK等[21]利用模擬葡萄汁培養(yǎng)基和長相思葡萄汁2種培養(yǎng)基，對釀酒酵母菌的2種不同菌株(實驗室菌株BY4743和商業(yè)菌株F15)進(jìn)行發(fā)酵,分析了葡萄酒發(fā)酵過程中VSCs的演化過程。在厭氧生長早期，甲硫醇的產(chǎn)量有一個短暫峰值；在整個發(fā)酵過程中，苯并噻唑和硫代乙酸乙酯等VSCs以穩(wěn)定的速率產(chǎn)生；二乙基硫化物等其他VSCs，在釀酒過程的最后階段產(chǎn)生。不同的酵母菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基之間存在顯著差異性。

2 揮發(fā)性硫化物對葡萄酒品質(zhì)的影響

2.1 揮發(fā)性硫化物對葡萄酒香氣的影響

現(xiàn)已報道的葡萄酒中呈香物質(zhì)大約有1 300余種，其中包括醇、醛、酯、酸、萜烯類物質(zhì)等，它們在葡萄酒中含量、性質(zhì)及相互之間的平衡賦予葡萄酒香氣,使其存在典型風(fēng)格和地域特異性。葡萄酒異味性會降低其品質(zhì)，甚至導(dǎo)致消費者排斥。還原味是葡萄酒中最常見的異味之一，這些異味主要是由巰基化合物(—SH)、H2S和甲硫醇等VSCs引起的[22]。FRANCO-LUESMA等[11]研究表明，H2S和甲硫醇參與了還原味的形成，抑制水果味和花香味。H2S會產(chǎn)生臭雞蛋味，而甲硫醇會顯著增加乳酪味，減少柑橘、煙熏/烤肉味。部分VSCs如4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮、3-巰基己醇和3-巰基己醇乙酸酯能夠構(gòu)成葡萄酒風(fēng)味，呈現(xiàn)出誘人的果香味(如黑莓、黃楊樹、西番蓮、葡萄柚)[23]。此外，不同濃度VSCs對葡萄酒香氣呈現(xiàn)不同的感官特征，如二甲基硫醚低濃度時帶來果香味，高濃度時則會破壞葡萄酒香氣，若陳釀中存在較高濃度的二甲基硫醚還容易出現(xiàn)金屬或者溫桲等異味[24]。

2.2 揮發(fā)性硫化物對葡萄酒色澤及口感的影響

VSCs能夠提高葡萄酒的穩(wěn)定性，也能有效防止葡萄酒氧化變酸，使酸度保持在一定范圍，同時防止多酚、單寧及色素物質(zhì)的氧化，避免造成在釀造和儲存過程中因氧化而造成的顏色渾濁。并且，硫化物的存在能夠防止在釀造過程中感染雜菌，所以在釀造初期會向葡萄汁中加入SO2以提高其穩(wěn)定性，加速澄清及殺死葡萄自身所帶細(xì)菌。

3 揮發(fā)性硫化物分析方法

葡萄酒中VSCs的含量比較低，僅有10～500 μg/L，但對葡萄酒的感官刺激較為明顯。由于其含量低，檢測閾值低，揮發(fā)性強(qiáng)等特點，使得對VSCs的提取及檢測均受到限制，傳統(tǒng)的檢測手段不能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行VSCs定性及定量分析。因此，在對葡萄酒異味物質(zhì)進(jìn)行檢測時，很難分析到準(zhǔn)確的呈香物質(zhì)，但近年來分析技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)譜儀及色譜儀的普及，使得檢測葡萄酒中VSCs更為便利準(zhǔn)確。

3.1 傳統(tǒng)揮發(fā)性硫化物分析方法

3.1.1 亞甲基藍(lán)分光光度法

H2S有一種臭雞蛋味，但檢測閾值很低(11～80 μg/L)，因此即使少量的H2S也可能對葡萄酒的香氣有害。此外，H2S可以與各種葡萄酒成分反應(yīng)，形成乙硫醇或其他具有負(fù)面風(fēng)味的揮發(fā)物[25]。利用亞甲基藍(lán)分光光度法對葡萄酒中H2S進(jìn)行檢測，向酒樣中加入指示劑和吸收液，酒樣中充入氮氣作為載氣帶出H2S，而后進(jìn)行水浴，充氣完成向里加入呈色試劑，進(jìn)行比色皿吸光度測定，檢出含量在42～76 μg/L[26]。操作簡便、速度快、穩(wěn)定性高是該方法相較于其他方法的優(yōu)點，缺點是該法只能檢測葡萄酒中的H2S氣體。

3.1.2 蒸餾法

食品中SO2測定通用方法是GB 5009.34—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中SO2的測定》,也稱蒸餾法。首先對樣品進(jìn)行酸化處理，而后進(jìn)行蒸餾釋放SO2，用乙酸鉛溶液作為吸收液，最后加濃鹽酸酸化，利用碘液進(jìn)行滴定。該法優(yōu)點是實驗周期短，操作簡單，缺點是H2S會發(fā)生氧化，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確[27]。

3.1.3 直接碘量法

相對于白葡萄酒，紅葡萄酒顏色，會影響滴定終點的判斷。但是通過對紅葡萄酒進(jìn)行前處理，利用脫色劑進(jìn)行脫色處理，然后再進(jìn)行碘液滴定；或者通過改變減小取樣體積，結(jié)合超聲輔助解離，此時滴定，采用半微量碘量法滴定，可以有效減少顏色干擾，分析結(jié)果無顯著影響[28]。

3.2 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的方法

色譜技術(shù)通常用于測定VSCs，由于VSCs檢測閾值很低，因此必須使用敏感和選擇性檢測系統(tǒng)。常見報道的檢測器有硫化學(xué)發(fā)光檢測器(sulfur chemilucminescence detector，SCD)[5,29]、火焰光度檢測器(flame photometric detector，F(xiàn)PD)[30]、脈沖火焰光度檢測器(pulsed flame photometric detector，pFPD)[31-32]、原子發(fā)射檢測器[33]和質(zhì)譜發(fā)射檢測器[34]。其中SCD因其高靈敏度和等摩爾響應(yīng)功能被廣泛用于葡萄酒中VSCs的檢測。FPD能提供較低的檢測極限，雖pFPD較FPD提高了靈敏度，靈敏度仍然不及SCD檢測方法。目前使用最廣泛的是MS，在使用MS檢測器時，必須進(jìn)行樣品預(yù)處理以及濃縮，從而滿足系統(tǒng)的可檢測性。

3.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

GC-MS是兼具氣相色譜和質(zhì)譜優(yōu)點的檢測方法，通過將目標(biāo)化合物片斷與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)參考物的片斷進(jìn)行比較，能夠同時完成待測樣品的分離和鑒定，具有更高的靈敏度和分辨率。FARHADI等[35]利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，解析了阿魏樣品(藥用植物)存在Z-1-丁炔基-1-甲基丙基二硫化物和E-1-丁炔基-1-甲基丙基二硫化物，并指出揮發(fā)性硫化物的代謝模式可作為鑒定阿魏(藥用植物)種類和含量的方法。TOMINAGA等[36]將羥基汞氯苯甲酸(p-hydroxymercuribenzoic acid，pHMB)添加到葡萄酒中，形成p-HMB -硫醇復(fù)合物，利用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測，測得2-甲基-3-呋喃硫醇為 50～145 ng/L，2-呋喃甲硫醇為25～140 ng/L。該方法相對簡便，并且能夠降低揮發(fā)性硫醇的損失。

復(fù)雜基質(zhì)中低含量揮發(fā)性物質(zhì)檢測比較困難，選擇合適的樣品預(yù)處理方法可以有效提升檢出靈敏度。穩(wěn)定同位素稀釋法(stable isotopic dilution mass spectrometry, SIDA)是一種準(zhǔn)確度和精度高的方法，不需要對被測物質(zhì)進(jìn)行定量分離，避免了復(fù)雜混合物體系定量分離、純化的困難，可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)。穩(wěn)定同位素稀釋-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸應(yīng)用到VSCs檢測中。CAPONE等[37]采用SIDA，同時結(jié)合頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction，HP-SPME)-GC-MS進(jìn)行分析，測得3-巰基己醇的定性和定量檢測限為30和40 ng/L，均低于其香氣閾值。

然而，部分VSCs在極低濃度下很難被識別，并且容易被其他較高濃度物質(zhì)掩蓋，可能會超出GC-MS的檢測范圍[38]。全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometer,GC×GC-TOFMS)對于分析復(fù)雜樣品是一種較好的選擇，GC×GC系統(tǒng)具有峰容量大、分辨率高的優(yōu)點。TOFMS分析儀的主要優(yōu)點是數(shù)據(jù)采集速度快、分析質(zhì)量范圍廣、分析靈敏度高、可同時檢測多個離子碎片[39]。YAN等[40]建立了HS-SPME與GC×GC-TOFMS相結(jié)合的分析方法，對醬香型白酒VSCs進(jìn)行表征，首次鑒定出了糠基甲基二硫化物、2-甲基-5-(甲硫基)呋喃、2-甲基-3-(甲基二硫)呋喃、S-甲基丁硫酸酯、噻吩、2-戊基噻吩和5-甲基-2-噻吩甲醛。此外，感官分析顯示，二甲基硫、二甲基二硫化物和二甲基三硫醚增強(qiáng)了白酒中水果香味。

綜上，由于葡萄酒基質(zhì)復(fù)雜，質(zhì)譜響應(yīng)低，一維GC-MS分離能力有限，只能鑒定出少量VSCs。GC×GC和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具有高分辨率和靈敏度的優(yōu)勢，將在全面科學(xué)表征以葡萄酒為代表的復(fù)雜基質(zhì)中的VSCs檢測發(fā)揮更大作用。

3.2.2 氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用法

GC-MS是一種有效的、常用的香氣分析技術(shù)，然而，其無法確定化合物的氣味特性及其貢獻(xiàn)，無法識別食品中影響其風(fēng)味的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物[41-42]。氣相色譜-嗅聞法(gas chromatography-olfactometry，GC-O)技術(shù)可對樣品中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，但并不能滿足于香氣成分在結(jié)構(gòu)分析上的需要。GC-O-MS GC-O和GC-MS的結(jié)合，是挖掘食品風(fēng)味的有力工具，已廣泛應(yīng)用于各種食品的香氣和風(fēng)味分析，逐漸成為揮發(fā)性硫化物研究方法的熱點領(lǐng)域[43]。VILLIERE等[44]采用HS-SPME技術(shù)提取酒中VSCs，利用GC-O-MS對16種葡萄酒進(jìn)行分析，檢測得到3-巰基己醇、4-甲基戊醇、乙酸乙酯等近50種香氣物質(zhì)。近年來，隨著“分子感官科學(xué)”(或感官導(dǎo)向風(fēng)味分析)學(xué)科的興起及其發(fā)展，GC-O-MS應(yīng)用也將更加廣泛。

3.2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GC-MS分析VSCs通常需要對樣品進(jìn)行衍生化處理增加穩(wěn)定性。HPLC-MS/MS對難揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性差的化合物具有良好的檢測性能，技術(shù)分離能力高，靈敏度好，專屬性強(qiáng)且應(yīng)用范圍廣[45]。CAPONE等[18]利用HPLC-MS/MS測定了葡萄酒中的硫醇，測得4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮為0.8～1.6 ng/L，3-巰基己醇為6.4～10.6 ng/L，3-巰基己醇乙酸酯為1.2～4.3 ng/L，2-糠醇為0.7～1.5 ng/L，芐基硫醇為1.1～3.7 ng/L。CHEN等[8]結(jié)合SIDA，利用HPLC-MS/MS檢測葡萄酒中硫醇，得到硫醇前體3-S-谷胱甘肽基己烷1-醇檢測范圍為33.7～170.7 μg/L，3-S-半胱氨酰己烷-1-醇檢測范圍為7.9～44.7 μg/L，品種硫醇3-磺酰己烷-1-醇檢測范圍為29～528 ng/L，3-磺酰基己酸乙酯檢測范圍為4～53 ng/L，且2種揮發(fā)性硫醇的濃度范圍均高于香氣閾值[8]。HPLC-MS/MS較傳統(tǒng)LC-MS而言簡化實驗步驟，節(jié)省時間，分析更加精確，在揮發(fā)性硫化物的檢測上應(yīng)用將更加廣泛。

綜上所述，目前葡萄酒中VSCs主要采用GC-MS和LC-MS(表2)，研究主要集中在硫化氫、甲硫醇、乙硫醇、二硫化碳、二甲基硫醚、二乙基硫醚、二甲基二硫醚、二乙基二硫醚、2-呋喃甲硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、3-巰基己醇、3-巰基己醇乙酸酯、4-巰基-4-甲基戊烷-2-酮、硫代乙酸甲酯、硫代乙酸乙酯、3-巰基己基丁酸、3-巰基-3-甲基丁酸乙酯、3-巰基-3-甲基丁烷-1-醇、2-糠醇、芐基硫醇、3-S-谷胱甘肽基己烷1-醇、3-S-半胱氨酰己烷-1-醇等硫醇及硫醇酯類物質(zhì)，而關(guān)于硫醚、含硫雜環(huán)化合物相關(guān)報道較少。葡萄酒基質(zhì)復(fù)雜，單獨使用某種檢測方法只能檢測到其中一種或幾種VSCs，并不能全面表征葡萄酒中的VSCs，更高分辨率和靈敏度的檢測方法有待進(jìn)一步開發(fā)。

表2 葡萄酒中 VSCs檢測方法比較Table 2 Comparison of detection method of VSCs in the wine

4 結(jié)語

成品葡萄酒中VSCs對于葡萄酒感官品質(zhì)具有重要影響。VSCs存在揮發(fā)性強(qiáng)、檢測閾值低和穩(wěn)定性差等難題，高效精準(zhǔn)定量葡萄酒中VSCs一直面臨一些挑戰(zhàn)。近年來，隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的進(jìn)步，GC-MS和LC-MS在VSCs檢測中發(fā)揮了重要作用，是目前葡萄酒中揮發(fā)性硫化物檢測的重要方法。然而，由于葡萄酒基質(zhì)復(fù)雜性和VSCs的低濃度，VSCs的分離富集依賴復(fù)雜的預(yù)處理方法，預(yù)處理溶劑往往存在化學(xué)毒性。開發(fā)復(fù)雜樣品中VSCs便捷、高靈敏度的檢測方法，有助于精準(zhǔn)調(diào)控葡萄酒感官特性，為創(chuàng)制高品質(zhì)葡萄酒提供保障。