細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合BRAF V600E基因檢測在TIRADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷中的價值

張柳婷，陳松旺，趙燕妹

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）超聲科，江蘇 南京 210000

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國每1 000人中約90人發(fā)病，且發(fā)病率呈現(xiàn)城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)、女性高于男性的分布特點［1］。韓國學(xué)者Kwak等［2］提出的甲狀腺影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Thyroid Imaging Reporting and Data System，TI-RADS）提示4類甲狀腺結(jié)節(jié)惡性概率為3.3%～72.4%，仍需甲狀腺結(jié)節(jié)活檢才可明確結(jié)節(jié)的性質(zhì)。美國甲狀腺學(xué)會（American Thyroid Association，ATA）認(rèn)為超聲引導(dǎo)下細(xì)針抽吸活組織檢查（ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy，US-FNAB）是診斷甲狀腺結(jié)節(jié)最準(zhǔn)確、最經(jīng)濟(jì)的方法［3］，現(xiàn)已成為鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)和病理學(xué)類型的一線方法，但是其結(jié)果存在假陰性、穿刺不滿意的情況［4-6］，因此提高甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷的準(zhǔn)確度還需要進(jìn)一步的輔助診斷方法。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）是甲狀腺癌中最常見的組織學(xué)類型［7］，而PTC患者中BRAF V600E突變率可高達(dá)87.69%［8-9］。故本研究分析了2019年7月—2020年3月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）行US-FNAB及BRAF V600E基因檢測的178例TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)患者資料，旨在探討細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合BRAF V600E基因檢測在TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷中的價值，為臨床制訂個體化治療方案提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2019年7月—2020年3月行US-FNAB、BRAF V600E基因檢測并且有手術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果的TI-RADS 4類結(jié)節(jié)患者。TI-RADS 4類標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)可疑惡性超聲表現(xiàn)（實性成分、低回聲、極低回聲、微分葉或不規(guī)則邊緣、微鈣化和縱橫比＞1）劃分，具有1項可疑惡性超聲表現(xiàn)為TI-RADS 4a類，有2項可疑惡性超聲表現(xiàn)為TI-RADS 4b類，有3、4項可疑惡性超聲表現(xiàn)為TI-RADS 4c類。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）行常規(guī)超聲檢查，且TI-RADS分類為4類的甲狀腺結(jié)節(jié)（包括4a～4c）；② 于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）行US-FNAB及BRAF V600E基因檢測；③ 有明確的術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果。共178例患者納入研究，其中女性130例，男性48例，平均年齡（45.6±12.1）歲，平均結(jié)節(jié)直徑為（10.76±6.16）mm。

1.2 方法

1.2.1 US-FNAB標(biāo)本采集

患者簽署知情同意書后，由副主任醫(yī)師以上的高年資醫(yī)師完成US-FNAB。采用意大利Esaote公司的MyLab 90彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭頻率為5～12 MHz，患者取仰臥位，先常規(guī)掃查甲狀腺，定位甲狀腺結(jié)節(jié)后消毒鋪巾，2%利多卡因溶液局部浸潤麻醉，然后在超聲引導(dǎo)下，將5 mL注射器的針頭推至結(jié)節(jié)中心并保持注射器的負(fù)壓狀態(tài)（圖1），反復(fù)提拉注射器后得到足夠的細(xì)胞，將其推至玻片上涂片，然后將玻片置于95%乙醇溶液中固定15 min，針筒內(nèi)殘余細(xì)胞用液基細(xì)胞保存液沖洗保存，重復(fù)取樣過程3、4次，用于細(xì)胞病理學(xué)診斷。最后一次取樣后，將注射器內(nèi)的標(biāo)本注入裝有細(xì)胞保存液的Ependorf試管內(nèi)保存，用于BRAFV600E基因檢測。

圖1 甲狀腺結(jié)節(jié)行US-FNAB術(shù)前及術(shù)中影像

1.2.2 US-FNAB標(biāo)本細(xì)胞病理學(xué)判讀

由3、4名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師共同完成判讀過程，根據(jù)Bethesda報告系統(tǒng)［10］將結(jié)果分為6類，Ⅰ類：標(biāo)本無法診斷或不滿意，標(biāo)本中＜6個濾泡細(xì)胞團(tuán)，且每團(tuán)細(xì)胞＜10個；Ⅱ類：良性病變；Ⅲ類：意義不明確的細(xì)胞非典型病變或意義不明確的濾泡性病變；Ⅳ類：濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類：可疑惡性腫瘤；Ⅵ類：惡性腫瘤。根據(jù)細(xì)胞學(xué)診斷的結(jié)果將結(jié)節(jié)分為兩組，A組由Bethesda Ⅱ類、Ⅴ類和Ⅵ類構(gòu)成，為細(xì)胞學(xué)診斷確切組，B組由Bethesda Ⅰ類、Ⅲ類及Ⅳ類構(gòu)成，為細(xì)胞學(xué)診斷模糊組。

1.2.3BRAFV600E檢測

使用德國Qiagen公司QIAamp DNA Micro Kit提取試劑盒抽提FNAB標(biāo)本的DNA，采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司人類BRAFV600E ARMS-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書步驟操作，在實時PCR儀中打開設(shè)置窗口并設(shè)定循環(huán)條件：95 ℃ 5 min（1個循環(huán)）；95 ℃25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s（15個循環(huán)）；93 ℃25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s（31個循環(huán)）。在60 ℃時收集突變和內(nèi)控信號，執(zhí)行實時PCR，并保存文件。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析研究中的數(shù)據(jù)，以術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計算A組中細(xì)胞學(xué)檢查、BRAFV600E基因檢測及兩種檢測方法聯(lián)合后鑒別TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）、陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV），應(yīng)用χ2檢驗比較USFNAB與兩種檢測方法聯(lián)合的結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并采用kappa檢驗，比較單獨細(xì)胞學(xué)檢查、基因檢測或二者結(jié)合后的結(jié)果與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的一致性，若κ＜0為一致性弱；κ＜0.7一致性一般；0.7＜κ＜0.9一致性較好；κ＞0.9一致性極好。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)、BRAF V600E基因檢測和Bethesda細(xì)胞學(xué)分類結(jié)果

本研究行US-FNAB和BRAFV600E基因檢測的結(jié)節(jié)患者共178例，TI-RADS 4a、4b、4c類分別有32、89、57例，均行手術(shù)治療且有組織病理學(xué)檢查結(jié)果（表1）。惡性病變158例，占88.8%（158/178），包括157例PTC，1例甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）。良性病變20例，占11.2%（20/178），包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫12例，淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎7例，濾泡型腫瘤1例。

表1 TI-RADS4類甲狀腺結(jié)節(jié)組織病理學(xué)情況

BRAFV600E突變型結(jié)節(jié)共126例，BRAFV600E野生型結(jié)節(jié)52例。細(xì)胞病理學(xué)檢查結(jié)果Bethesda Ⅰ類2例，Ⅱ類20例，Ⅲ類9例，Ⅳ類1例，Ⅴ類142例，Ⅵ類4例。178例結(jié)節(jié)的組織病理學(xué)結(jié)果、BRAFV600E基因檢測和Bethesda細(xì)胞學(xué)分類結(jié)果如表2所示。

表2 178例結(jié)節(jié)患者的Bethesda細(xì)胞學(xué)分類、BRAF V600E基因檢測和組織病理學(xué)結(jié)果

2.2 A組中BRAF V600E基因檢測、細(xì)胞學(xué)檢查及二者聯(lián)合的診斷效能比較

A組中的Bethesda Ⅱ類為良性結(jié)果，Bethesda Ⅴ類和Ⅵ類為惡性結(jié)果，以術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，故US-FNAB鑒別結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為97.3%、88.9%及96.4%，細(xì)胞病理學(xué)檢查與組織病理學(xué)檢查結(jié)果一致性較好（κ=0.822±0.071）。BRAFV600E基因檢測鑒別結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度分別為80.4%、100.0%及82.5%，一致性方面，BRAFV600E檢測結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果一致性一般（κ=0.471±0.076）。

細(xì)胞學(xué)檢查、BRAFV600E突變基因檢測兩種檢查方法聯(lián)合預(yù)測結(jié)節(jié)良惡性的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度為99.3%、88.9%及98.2%，一致性檢驗中，細(xì)胞學(xué)檢查與基因檢測結(jié)合后與組織病理學(xué)檢查結(jié)果一致性極好（κ=0.904±0.055，表3）。比較兩種檢測方法聯(lián)合后與US-FNAB的診斷準(zhǔn)確程度，χ2=74.5，P＜0.05，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 3種方法的診斷效能比較

2.3 B組中BRAF V600E基因檢測的診斷價值

如表2所示，B組共12例結(jié)節(jié)，共有7例發(fā)生BRAFV600E突變，均被術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果證實為PTC。其中Bethesda Ⅰ類結(jié)節(jié)中有1例存在BRAFV600E突變，9例Bethesda Ⅲ類結(jié)節(jié)中，表現(xiàn)為BRAFV600E突變型的共6例，Bethesda Ⅳ類結(jié)節(jié)中未發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變。

3 討 論

US-FNAB是術(shù)前對甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷的常用手段，而目前在行US-FNAB時增加分子標(biāo)志物檢測以提高其準(zhǔn)確度受到廣泛關(guān)注［11］，甲狀腺癌內(nèi)較常見的突變類型有BRAF突變、RAS突變、RET/PTC重排、Pax8-PPARγ融合基因等［12］。B R A F基因位于人類7號染色體（7q34），其編碼的蛋白質(zhì)本質(zhì)上為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，同時也是激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的關(guān)鍵分子［13-14］。BRAF基因已鑒定出的40多種突變中的T1799A型占所有突變的90%以上［15］，該突變?yōu)锽RAF基因第15個外顯子上第1 799位發(fā)生點突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)第600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）取代，所以也被稱為BRAFV600E突變。BRAF突變使得MAPK通路被持續(xù)激活，細(xì)胞不斷增殖形成腫瘤［16］。有學(xué)者［17］認(rèn)為，BRAF突變在甲狀腺癌的進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用，同時BRAFV600E在甲狀腺癌中突變頻率較高，且與高危臨床病理特征、不良預(yù)后相關(guān)［18-21］，而且BRAFV600E檢測的靈敏度和特異度也較高［22］，故本研究選擇該位點。

納入本研究的178例結(jié)節(jié)患者中共126例檢測到BRAFV600E突變，術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果證實均為PTC，52例未發(fā)生BRAFV600E突變，有20例為甲狀腺良性病變，BRAFV600E基因檢測的特異度高達(dá)100.0%，準(zhǔn)確度為82.5%，靈敏度為80.4%，但是與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的一致性一般，所以BRAF V600E檢測結(jié)果并不能很好地反映組織病理學(xué)檢查結(jié)果，而且由于BRAF V600E只存在于PTC和部分起源于PTC的間變性甲狀腺癌［23］，故基因檢測的陰性結(jié)果并不能排除其他類型甲狀腺腫瘤的可能，也就無法單獨使用其對TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行術(shù)前定性診斷。

本研究根據(jù)細(xì)胞病理學(xué)檢查結(jié)果將結(jié)節(jié)分為兩組，A組（診斷確切）和B組（診斷模糊），以明確BRAF V600E基因檢測的診斷價值。A組中有20例Bethesda Ⅱ類結(jié)節(jié)中出現(xiàn)4例假陰性，而其中有3例發(fā)生BRAF V600E突變。因BRAF V600E突變特異度較高，若術(shù)前參照基因檢測結(jié)果，便可知該3例結(jié)節(jié)為惡性腫瘤可能性大，由此可知，US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測可在一定程度上避免假陰性結(jié)果。A組內(nèi)146例Bethesda Ⅴ類結(jié)節(jié)中有2例為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴部分濾泡上皮呈乳頭狀改變，為細(xì)胞學(xué)診斷出現(xiàn)假陽性，基因檢測結(jié)果均未見突變。正如前文所述，BRAF V600E突變僅存在于PTC中，故BRAF V600E基因檢測的陰性結(jié)果并不能排除惡性腫瘤，所以其并不能避免假陽性的出現(xiàn)。

A組中的結(jié)節(jié)如將BRAF V600E基因檢測應(yīng)用于US-FNAB中，鑒別結(jié)節(jié)良惡性的準(zhǔn)確度和靈敏度可達(dá)98.2%和99.3%，均比單獨行USFNAB的96.4%和97.3%有所提升，這與部分文獻(xiàn)［24-25］報道接近。在一致性檢驗中，BRAF V600E聯(lián)合US-FNAB的κ值為0.904±0.055，而單獨行US-FNAB的κ值為0.822±0.071，前者與組織病理學(xué)診斷的一致性極好，后者一致性較好。雖然US-FNAB的κ值小于兩種檢測方法聯(lián)合，但是其診斷準(zhǔn)確度與靈敏度均差于兩種檢測方法聯(lián)合。綜上，在細(xì)胞學(xué)診斷確切的結(jié)節(jié)中BRAF V600E基因檢測聯(lián)合US-FNAB既能及時彌補(bǔ)假陰性的情況，又能提高診斷準(zhǔn)確度，繼而提高術(shù)前定性診斷的效率。

而在B組（診斷模糊）中，共有10例患者的結(jié)節(jié)被組織病理學(xué)結(jié)果證實為PTC，分別為Bethesda Ⅰ類1例（50.0%），Ⅲ類9例（100.0%），其余2例均為良性病變。盡管細(xì)胞學(xué)診斷無法給予準(zhǔn)確的結(jié)果，但是Bethesda Ⅰ類、Ⅲ類結(jié)節(jié)仍有5%～10%、6%～18%的概率為惡性腫瘤［26］，可是若依靠基因檢測的陽性結(jié)果，比如此次研究中B組最終診斷為PTC的結(jié)節(jié)中7例發(fā)生BRAF V600E突變，臨床便可推測結(jié)節(jié)為惡性腫瘤可能性大，及時給予手術(shù)治療避免重復(fù)行US-FNAB對患者造成經(jīng)濟(jì)及心理壓力。故基因檢測具有一定的補(bǔ)充作用，可通過US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測提高惡性結(jié)節(jié)的檢出率，提高術(shù)前定性診斷的準(zhǔn)確度，這與相關(guān)文獻(xiàn)［27］的結(jié)論一致。

本研究為回顧性研究，根據(jù)術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果收集結(jié)節(jié)信息，部分US-FNAB結(jié)果顯示為良性（Bethesda Ⅱ類）的結(jié)節(jié)選擇隨訪觀察時，即使基因檢測結(jié)果為BRAF V600E突變，也會因為缺乏術(shù)后組織病理學(xué)檢查結(jié)果而被排除在研究范圍外，造成一定程度的偏倚。由此可見，在TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)行US-FNAB時增加BRAF V600E基因檢測后診斷效率有所提升，無論細(xì)胞學(xué)診斷確切與否BRAF V600E基因檢測都能夠篩查出部分惡性結(jié)節(jié)，提高定性診斷的準(zhǔn)確度。所以在TI-RADS 4類甲狀腺結(jié)節(jié)中，細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合BRAF V600E基因檢測，能夠提高定性診斷的效率，減少手術(shù)治療延誤的可能，而且避免重復(fù)行US-FNAB或者密切隨訪帶來的經(jīng)濟(jì)及心理壓力，具有在臨床中廣泛應(yīng)用的價值。