表面活性蛋白A在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及炎癥調(diào)節(jié)作用

趙正，王曉鳳，李茂新，楊雪

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004）

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘疾病，其發(fā)病機(jī)制與異常的自身免疫反應(yīng)有關(guān)［1］。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的常駐免疫細(xì)胞，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，在病理?xiàng)l件下被激活并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)［2-3］。在多發(fā)性硬化發(fā)病過程中，外周異常增多的自身反應(yīng)性 T 淋巴細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號通路，進(jìn)而產(chǎn)生各種促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與多發(fā)性硬化的病理改變［4-5］。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）［6-7］，活化后的 TLR4 能促發(fā)細(xì)胞內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），進(jìn)而調(diào)節(jié)多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，通過 TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在多發(fā)性硬化的病理生理過程中至關(guān)重要［8］。

表面活性蛋白 A（surfactant protein A，SPA）在肺組織和肺外多個組織器官中表達(dá)并發(fā)揮免疫炎癥調(diào)節(jié)作用［9］。研究［10-12］發(fā)現(xiàn) SPA 能結(jié)合TLR4，并能抑制 TLR4 與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）結(jié)合，從而減弱其引發(fā)的 NF-κB 活化級聯(lián)反應(yīng)。然而，SPA是否在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，是否通過 TLR4 信號通路參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫炎癥反應(yīng)目前尚未見報(bào)道。本研究探討SPA在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其炎癥調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞及主要試劑

清潔級健康6～8周Lewis雌性大鼠10只，體質(zhì)量180～220 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠單籠飼養(yǎng)并自由進(jìn)食專用飼料及蒸餾水，室溫18～22 ℃，相對濕度40%～60%，保持墊料清潔及空氣暢通并維持12 h晝夜節(jié)律，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。人星形膠質(zhì)細(xì)胞及人小膠質(zhì)細(xì)胞（cat.nos.1800和1900）購自美國ScienCell Research Laboratories公司，應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；人SPA購自美國Abcam公司；山羊SPA抗體、兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白抗體鈣離子（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）、兔TLR4抗體及兔NF-κB抗體購自美國Santa公司；驢抗兔和驢抗山羊熒光二抗購自美國Invitrogen公司；驢血清、DAB染色劑及LPS購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA檢測：

1.2.1.1 大鼠腦組織切片星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA檢測 采用免疫熒光雙染法，水合氯醛麻醉大鼠后迅速斷頭取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋并切片（厚度 4 μm）。切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；PBS 洗滌切片 5 min，3 次，滴加 5% BSA 封閉，室溫下孵育 30 min；滴加SPA 和GFAP混合液或SPA和 Iba-1一抗混合液，保濕盒內(nèi)4 ℃ 孵育過夜。恢復(fù)至室溫，PBS 洗滌切片 5 min，3 次，滴加雜二抗混合液，常溫下于避光保濕盒內(nèi)孵育 2 h；PBS 避光下洗滌切片 5 min，3 次，Hoechst 33258 染核 3 min；PBS 避光下洗滌切片 5 min，3 次，加入防淬滅劑封片，用正置熒光顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.1.2 體外人星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中SPA檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法，未經(jīng)處理的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞爬片，于蓋玻片上生長3 d后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片 4%多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗滌 5 min，3 次，然后置于 3% H2O2室溫下孵育 15 min；PBS 洗滌 5 min，3 次，加入正常山羊血清，室溫下孵育 30 min；滴加SPA一抗，保濕盒內(nèi)4 ℃ 孵育過夜；切片放至室溫后PBS 洗滌 5 min，3 次，滴加二抗，室溫下孵育 30 min；PBS 洗滌切片 5 min，3 次，滴加 SP 試劑，室溫下孵育 30 min；PBS 洗滌切片 5 min，3 次，光學(xué)顯微鏡下 DAB 顯色；蘇木素核復(fù)染 5 min，1%鹽酸乙醇中分化 10 s，自來水沖洗返藍(lán) 20 min；梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，未滴加一抗的切片作為對照，觀察SPA在體外星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)和分組：（1）按照不同濃度LPS處理分組，使用含不同濃度（1、5、10 μg/mL）LPS培養(yǎng)液分別培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞24 h，并以0 μg/mL LPS 作為對照組。（2）按照LPS處理不同時(shí)間分組，應(yīng)用含有10 μg/mL LPS的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞及人小膠質(zhì)細(xì)胞 2、4、8、16、24 h，以10 μg/mL LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)0 h作為對照，檢測各組細(xì)胞中SPA表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。（3）按照不同處理方式分組，LPS組（5 μg/mL LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 8 h）、LPS+SPA組（5 μg/mL LPS 和 0.5 μg/mL SPA的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 8 h）、SPA組（0.5 μg/mL SPA 的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 8 h）、陰性對照組（未加入任何處理因素的培養(yǎng)基培養(yǎng)）。檢測各組細(xì)胞中TLR4 和 NF-κB p65 蛋白表達(dá)以及各組培養(yǎng)液中 TNF-α和 IL-1β的水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.2.3 Western blotting檢測細(xì)胞中SPA、TLR4和NF-κB p65的表達(dá)：將人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以2×106/孔接種至6孔板中，按照1.2.1中分組方式處理。各組細(xì)胞用RIPA裂解液（250 μL）冰上裂解20 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min；取上清行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)，室溫封閉2 h，用TBST液洗膜5 min，3 次；加入一抗，4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。TBST漂洗膜3遍，加二抗，室溫孵育2h。將PVDF膜放入顯影儀面板上，加入200 μL顯影液，暗室中顯影、定影、洗片。利用 Scion Image（美國Scion Corporation公司）軟件檢測各蛋白條帶灰度值，將各蛋白和β-actin 灰度值比值作為蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次 。

1.2.4 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的表達(dá)：取各組細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min 離心 5 min，取上清液，按照 ELISA檢測試劑盒說明書檢測TNF-α和 IL-1β的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中SPA表達(dá)

大鼠腦組織中免疫熒光雙重染色共定位結(jié)果顯示，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中可見SPA表達(dá)（圖1），而小膠質(zhì)細(xì)胞未見SPA表達(dá)（圖2）。

圖1 SPA和GFAP雙重免疫熒光染色Fig.1 Double-immunofluorescence staining for SPA and GFAP detection

圖2 SPA 和 Iba-1 雙重免疫熒光染色Fig.2 Double-immunofluorescence staining for SPA and Iba-1 detection

2.2 體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA表達(dá)

免疫組化結(jié)果（圖3）顯示，人星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均可見 SPA表達(dá)（圖3A），與大鼠腦組織不同，人小膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中可見 SPA 表達(dá)（圖3C）。

圖3 體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中 SPA 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of SPA in human astrocytes and microglial cells

2.3 LPS 處理對體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA表達(dá)的影響

應(yīng)用不同濃度（0～10 μg/mL）LPS處理細(xì)胞 24 h后的檢測結(jié)果顯示，人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA 水平均隨 LPS濃度上升而增高。與對照組（0 μg/mL LPS）比較，1、5 μg/mL LPS 處理組人星形膠質(zhì)細(xì)胞中SPA 表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），而 10 μg/mL LPS 處理組SPA 水平顯著升高（P＜0.05）；1 μg/mL LPS 處理組人小膠質(zhì)細(xì)胞中 SPA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），而 5、10 μg/mL LPS處理組SPA水平顯著升高（P＜ 0.05），且10 μg/mL LPS處理組SPA水平較1、5 μg/mL LPS處理組顯著升高（P＜0.05）。同時(shí)，采用10 μg/mL LPS 分別處理人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞2、4、8、16、24 h結(jié)果顯示，2種細(xì)胞都沒有出現(xiàn)時(shí)間依賴性的變化趨勢。見圖4、表1、表2。

圖4 不同濃度和不同時(shí)間 LPS 處理的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA 的表達(dá)Fig.4 SPA expression in human astrocytes and microglia cells exposed to varying LPS doses，or to 10 μg/mL LPS for varying durations

表1 不同濃度 LPS 處理24 h對體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA表達(dá)的影響Tab.1 SPA expression in human astrocytes and microglia cells exposed to varying doses of LPS for 24 h

表2 10 μg/mL LPS處理不同時(shí)間對體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞中SPA表達(dá)的影響Tab.2 SPA expression in human astrocytes and microglia cells exposed to 10 μg/mL LPS for different durations

2.4 SPA抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路活化

結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，LPS 組星形膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+SPA組TLR4和NF-κB p65水平均顯著下降（P＜ 0.05）。而 SPA 組與陰性對照組比較TLR4 與NF-κB p65 表達(dá)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05）。小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，SPA 同樣抑制了 LPS 誘導(dǎo)的 TLR4 和NF-κB p65表達(dá)，見圖5、表3。

圖5 各組人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4 和NF-κB p65表達(dá)Fig.5 TLR4 and NF-κB p65 proteins in human astrocytes and microglia

表3 各組人星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4 與NF-κB p65表達(dá)比較Tab.3 Levels of TLR4 and NF-κB p65 proteins in human astrocytes and microglia

2.5 SPA 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 TNF-α和 IL-1β的產(chǎn)生

結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，LPS組的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和人小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的 TNF-α和IL-1β水平均顯著升高（P＜ 0.05）。人星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中，LPS+SPA 組與LPS 組比較 IL-1β顯著減少（P＜ 0.05），而2組間TNF-α水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）；而在人小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中LPS+SPA 組TNF-α和 IL-1β水平較LPS組均明顯下降（P＜ 0.05）。SPA組與陰性對照組TNF-α和 IL-1β水平在2種細(xì)胞培養(yǎng)液中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。見表4。

表4 各組人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中 TNF-α 和 IL-1β水平比較（pg/mL）Tab.4 ELISA detection of TNF-α and IL-1β levels in the culture medium（pg/mL）

3 討論

多發(fā)性硬化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎病理過程的發(fā)生發(fā)展與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞——星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用息息相關(guān)。在多發(fā)性硬化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病過程中，外周異?；罨拿庖呒?xì)胞（CD4+T 細(xì)胞等）穿過受損的血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結(jié)合并激活靜止?fàn)顟B(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞?；罨蟮哪z質(zhì)細(xì)胞通過多種炎癥信號通路產(chǎn)生并釋放促炎性細(xì)胞因子及趨化因子等介質(zhì)，發(fā)揮抗原提呈等多種免疫功能參與神經(jīng)免疫的調(diào)控［13-14］。本研究采用免疫熒光雙染方法觀察 SPA在大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中可見SPA表達(dá)，而小膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)；但在體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中都觀察到SPA 表達(dá)，這可能與 SPA 在不同物種間的表達(dá)差異有關(guān)。近年來，研究［9-10］發(fā)現(xiàn)多種組織器官的炎癥疾病中都可檢測到 SPA 水平變化，認(rèn)為 SPA 水平可反映炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

LPS是一種炎癥激活物質(zhì)，常用于建立體外實(shí)驗(yàn)的炎癥模型。本研究結(jié)果證實(shí)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中LPS以劑量依賴方式促進(jìn)SPA表達(dá)，參與兩種膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。研究［12-16］證實(shí)SPA能通過特異性受體介導(dǎo)并調(diào)節(jié)下游的炎癥信號通路，SPA能直接與細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，并能抑制 TLR4與LPS的結(jié)合，從而減弱其引發(fā)的NF-κB活化級聯(lián)反應(yīng)。TLR4是LPS最適合的結(jié)合受體之一［17］，TLR4在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)豐富，能夠介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞因子表達(dá)，是2種膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要受體蛋白。研究［17-18］證實(shí)，在LPS刺激下，膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的TLR4及其下游NF-κB水平都隨LPS濃度增加而升高。由此推測SPA可能參與調(diào)節(jié)2種膠質(zhì)細(xì)胞的TLR4 及其下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激能使人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的TLR4和NF-κB p65水平升高，并促進(jìn)了炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的釋放，而加入外源性SPA 能抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4和NF-κB p65表達(dá)以及炎性細(xì)胞因子釋放。單獨(dú)加入 SPA并不能產(chǎn)生促進(jìn)或抑制TLR4和NF-κB活化的作用。因此認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)過程中，SPA能夠抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4/NF-κB活化，減少下游炎性細(xì)胞因子釋放，并通過這種途徑抑制兩種膠質(zhì)細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)。

SPA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制可能十分復(fù)雜：（1）SPA是 TLR4的配體，SPA有可能通過結(jié)合 TLR4來抑制其活化，影響炎癥信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)；（2）SPA又能結(jié)合LPS，它亦或通過與LPS相互作用干擾其結(jié)合TLR4 而產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)作用［19］；（3）SPA 還是多個受體（TLR2、CD14 和 gp-340 等）的內(nèi)源性配體，這些受體都能促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，LPS誘導(dǎo) SPA表達(dá)升高有可能反過來通過結(jié)合這些抗體調(diào)節(jié)了其下游信號通路［20-21］。SPA在人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出的抗炎癥作用可能是以上3種途徑綜合作用的結(jié)果，但這些推論仍需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

綜上所述，SPA在大鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞以及人星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，推測SPA是通過調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的 TLR4信號通路參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫炎癥調(diào)節(jié)。本研究為SPA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫調(diào)控作用提供了新的證據(jù)。