雞菌菌絲體固體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

張明星 李 潔 張玄妮 李歡歡 謝 娟 徐學(xué)鋒

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（2）培養(yǎng)基原材料與儀器

培養(yǎng)基原材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸提物、可溶性淀粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)；硝酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂，廣東光華化學(xué)廠有限公司生產(chǎn)；葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鉀，天津福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；麥芽糖、乳糖、蔗糖，天津福宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；顆粒直徑為0.075 mm的膨化豆粕，益海（連云港）糧油工業(yè)有限公司生產(chǎn)；顆粒直徑為0.075 mm的小麥麩皮，益海嘉里（鄭州）食品工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

儀器：HVE-50型全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本Hi?rayama公司；雷磁pHs-25型數(shù)顯pH計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TG-16W臺(tái)式高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)，常州市國(guó)旺儀器制造有限公司；101AS-3電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海浦東躍東欣科學(xué)儀器廠；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；SPH-2102C立式恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海四平試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

（3）供試培養(yǎng)基及制備方法

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：200.0 g土豆熬汁過(guò)濾后加葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH。

改良PD（Potato Dextrose）培養(yǎng)基：于1 L的PD培養(yǎng)基中加入硫酸鎂1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，自然pH。改良PDA培養(yǎng)基：于改良PD培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g。

圖1 雞菌的生長(zhǎng)特性（雞菌菌絲的鏡檢觀察均在40倍物鏡下）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)溫度試驗(yàn)：向改良PDA平板（直徑9 mm）培養(yǎng)基接入直徑2 mm雞菌菌絲塊，于22℃、25℃、28℃、31℃、34℃暗培養(yǎng)。觀察不同培養(yǎng)溫度雞菌菌絲生長(zhǎng)情況。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

初始pH試驗(yàn)：以改良PDA平板培養(yǎng)基為pH試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1%NaOH和1%HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9。其他操作同溫度試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度28℃。觀察不同pH條件下的雞菌菌絲生長(zhǎng)情況。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

氮源試驗(yàn)：以20 g葡萄糖，20 g瓊脂為基礎(chǔ)分別加入供試氮源。氮源添加量（g/L）分別為酵母浸膏3.0、蛋白胨3.0、硝酸銨3.0、牛肉膏3.0、膨化豆粕5.0、麥芽浸汁2.0。其他操作同溫度試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度28℃。觀察不同氮源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

碳源試驗(yàn)：以20 g瓊脂為基礎(chǔ)分別加入質(zhì)量濃度為2 g/L的供試碳源。碳源分別為葡萄糖、乳糖、麩皮、淀粉、蔗糖，麥芽糖。其他操作同溫度試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度28℃。觀察不同碳源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

礦物質(zhì)試驗(yàn)：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基PDA中分別加入 硫 酸 鎂 0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L；磷 酸 二 氫 鉀0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L；硫酸銅 0、0.015 g/L、0.030 g/L、0.045 g/L、0.060 g/L、0.075 g/L（硫酸銅溶液要單獨(dú)滅菌后加入）。其他操作同溫度試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度28℃。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 最優(yōu)組合篩選

從接種第5天開(kāi)始采用十字交叉法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)量，每隔5 d測(cè)一次，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，連續(xù)測(cè)量30 d。計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度，并觀察記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用新復(fù)極差法對(duì)各試驗(yàn)處理進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

注：數(shù)據(jù)為三次重復(fù)平均值。相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下同。

菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.09 1.24 1.37 1.23 0.00菌絲長(zhǎng)勢(shì)菌絲稀菌絲較密菌絲較密較稀不長(zhǎng)溫度/℃22 25 28 31 34差異顯著性b c d c a

2.2 p H對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表2 初始p H對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表2 初始p H對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

pH 4 5 6 7 8 9菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.31 1.21 1.20 1.17 1.14 1.07差異顯著性b ab ab ab ab a菌絲長(zhǎng)勢(shì)菌絲較密菌絲稀較稀較稀較稀較稀

2.3 硫酸鎂對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 磷酸二氫鉀對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 硫酸鎂對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 硫酸鎂對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

硫酸鎂/（g·L-1）0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.11 1.09 1.23 1.26 1.38 1.52 1.24 1.09差異顯著性a a b b c d b a菌絲長(zhǎng)勢(shì)較稀菌絲稀菌絲稀較稀菌絲稀菌絲稀菌絲較密較稀

表4 磷酸二氫鉀對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表4 磷酸二氫鉀對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

磷酸二氫鉀/（g·L-1）0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.14 1.22 1.23 1.26 1.29 1.36 1.34 1.37差異顯著性a ab ab ab ab b b b菌絲長(zhǎng)勢(shì)較稀菌絲稀菌絲較密菌絲稀菌絲茂密菌絲較密菌絲較密菌絲較密

2.5 硫酸銅對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表5 硫酸銅對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表5 硫酸銅對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

硫酸銅/（g·L-1）0 0.015 0.030 0.045 0.060 0.075菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.23 1.06 0.96 0.90 0.82 0.85差異顯著性c b a b a a a菌絲長(zhǎng)勢(shì)菌絲較密菌絲稀菌絲稀較稀較稀較稀

2.6 供試碳源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表6 供試碳源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表6 供試碳源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

碳源乳糖麩皮蔗糖麥芽糖葡萄糖淀粉菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）0.33 0.70 1.23 1.42 1.24 1.66差異顯著性a b c d c e菌絲長(zhǎng)勢(shì)向上堆積較稀菌絲稀菌絲較密菌絲較密菌絲較密

2.7 供試氮源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表7 供試氮源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

表7 供試氮源對(duì)雞菌菌絲生長(zhǎng)的影響

氮源硝酸銨蛋白胨牛肉膏酵母浸膏麥芽浸汁膨化豆粕菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.08 1.33 1.24 1.46 1.22 1.18差異顯著性a cd bc d bc ab菌絲長(zhǎng)勢(shì)較稀菌絲較密菌絲較密菌絲茂密菌絲稀菌絲較密

2.8 組合試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

真菌菌絲的生長(zhǎng)速度受到培養(yǎng)方式及培養(yǎng)基質(zhì)的影響，借鑒前人的研究方法對(duì)雞菌菌絲固體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)雞菌菌絲，菌絲平均長(zhǎng)速達(dá)1.41 mm/d。筆者在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雞菌菌株活性受保存溫度及培養(yǎng)基影響較大，因此對(duì)該菌種保藏要額外注意，保存方法可參考馬濤等[13]的研究結(jié)果。

表8 雞菌菌絲生長(zhǎng)的固體基質(zhì)最優(yōu)組合

表8 雞菌菌絲生長(zhǎng)的固體基質(zhì)最優(yōu)組合

試驗(yàn)號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9氮源酵母膏酵母膏酵母膏蛋白胨蛋白胨蛋白胨牛肉膏牛肉膏牛肉膏碳源淀粉麥芽糖葡萄糖淀粉麥芽糖葡萄糖淀粉麥芽糖葡萄糖硫酸鎂/（g·L-1）2.0 2.5 3.0 2.5 3.0 2.0 3.0 2.0 2.5菌絲平均長(zhǎng)速/（mm·d-1）1.13b 1.31 bcd 1.28 bcd 0.86 a 1.18 bc 1.41 d 1.14 b 1.24 bcd 1.38 cd