PPARγ在結(jié)核分枝桿菌感染小鼠脂質(zhì)代謝中的作用*

趙曉杰，韓曉群，鄧 琴，楊 婧，周智興，劉冬梅，王海利

（宜春學(xué)院1化學(xué)與生物工程學(xué)院，2醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫與微生物學(xué)教研室，江西宜春336000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的、嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道傳染病。目前盡管在監(jiān)測(cè)和治療肺結(jié)核方面做出了持續(xù)和廣泛的努力，但全球每年仍有約20億人感染MTB，100多萬(wàn)人死于結(jié)核病及其并發(fā)癥［1］。因而，探索針對(duì)細(xì)菌和宿主的治療方法以阻止MTB感染和進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病迫在眉睫。

MTB在宿主體內(nèi)可通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)，從而為其適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的生活方式提供條件［2］，其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）便是在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的胞內(nèi)誘導(dǎo)基因之一。PPARγ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，與視黃醇X受體（retinoid X receptor，RXR）形成異二聚體，通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性PPAR反應(yīng)元件（PPAR-response elements，PPRE）結(jié)合，調(diào)控多種基因表達(dá)［3］，使其成為一種穩(wěn)定的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)劑，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］、細(xì)胞分化［5］、脂質(zhì)代謝［6］和炎癥反應(yīng)［7-8］等多種病理生理過(guò)程［9］。

研究證實(shí)，MTB感染巨噬細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)在脂質(zhì)聚集中發(fā)揮重要作用［10］，而脂質(zhì)聚集有助于細(xì)胞內(nèi)MTB的存活和/或復(fù)制［11］，但其作用是否通過(guò)PPARγ依賴途徑及其機(jī)制尚未闡明。另外，PPARγ的抑制在體內(nèi)MTB感染過(guò)程中能否增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的清除作用尚無(wú)體內(nèi)研究予以證實(shí)。因此，本研究通過(guò)探討PPARγ對(duì)MTB感染小鼠機(jī)體脂質(zhì)代謝及肺組織損傷的影響及機(jī)制，為揭示MTB的致病機(jī)理提供重要線索，為結(jié)核病的防治提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。細(xì)菌在含有馬鈴薯、蛋黃、孔雀綠的羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，無(wú)菌濾過(guò)，調(diào)整單細(xì)胞懸液菌濃度為5×109CFU/L，分裝凍存于-80℃低溫冰箱備用。

6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠60只，體重18～20 g，購(gòu)自三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物在感染前1周進(jìn)入生物安全Ⅲ級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑Trizol試劑購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；高效RNA-cDNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；油紅O購(gòu)自Sigma；抗CD36抗體購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法實(shí)驗(yàn)分4組：（1）對(duì)照（control）組：尾靜脈注射PBS；（2）MTB組：尾靜脈注射MTB菌液，感染劑量為5×105CFU；（3）MTB+羅格列酮（rosiglitazone，ROZ）組：注射MTB前3 d，給予ROZ灌胃，劑量為4 mg·kg-1·d-1，注射MTB后1 h再給予當(dāng)天的羅格列酮灌胃，以后按照計(jì)劃劑量（4 mg·kg-1·d-1）給予灌胃；（4）MTB+GW9662組：注射MTB后1 h，給予腹腔內(nèi)注射GW9662，劑量為4 mg/kg，以后按照計(jì)劃劑量（4 mg·kg-1·d-1）給予GW9662腹腔注射。按照以上分組方法處理小鼠6周后，禁食12 h，斷頭采血，離心分離血漿，置于-80℃冰箱保存。取小鼠部分肺組織置于-80℃冰箱保存?zhèn)錅y(cè)PPARγ表達(dá)，剩余肺組織進(jìn)行油紅染色、荷菌量檢測(cè)及病理分析。

2.2 肺組織荷菌量檢測(cè)嚴(yán)格無(wú)菌條件下取各組小鼠肺組織充分漂洗，加入生理鹽水1mL，用組織勻漿器研磨制備組織懸液，取0.1mL以生理鹽水作10倍倍比稀釋，取各稀釋度的組織稀釋液100μL接種于羅氏斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每個(gè)斜面上的菌落數(shù)在5～50 CFU范圍內(nèi)的稀釋度進(jìn)行組織荷菌量計(jì)算。

2.3 HE染色觀察肺組織的病理變化取各組小鼠部分肺組織，用4%多聚甲醛固定液固定24h，經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋、切片及脫蠟、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)肺組織PPARγ的mRNA表達(dá)取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍肺組織制成組織勻漿，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［12］，采用RT-qPCR檢測(cè)肺組織PPARγ的mRNA表達(dá)。引物序列如表1所示。以β-actin為內(nèi)參照，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。mRNA水平用β-actin表達(dá)的相對(duì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequences for RT-qPCR

2.5 Western blot檢測(cè)肺組織PPARγ的蛋白表達(dá)取肺組織100 mg，用RIPA裂解液提取肺組織中的蛋白。按常規(guī)操作進(jìn)行PPARγ的Western blot檢測(cè)，蛋白條帶通過(guò)化學(xué)發(fā)光劑顯影，用BandScan分析膠片灰度值，目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過(guò)β-actin進(jìn)行校正。

2.6 油紅O染色觀察肺組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積冰凍切片用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水洗，繼之以60%異丙醇浸洗，油紅O染液染10 min，60%異丙醇分色至背景無(wú)色，再次蒸餾水洗。Mayer蘇木素復(fù)染數(shù)分鐘，PBS浸洗（藍(lán)化）3 min。蒸餾水洗后水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA檢測(cè)血漿脂質(zhì)水平使用TC、TG、LDLC和HDL-C試劑盒，采用ELISA在全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）上進(jìn)行檢測(cè)。

2.8 免疫組化檢測(cè)肺組織CD36的表達(dá)組織塊經(jīng)乙醇脫水后經(jīng)二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟后，加適量的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。3%的過(guò)氧化氫滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。加Ⅰ抗后于4℃濕盒中孵育過(guò)夜（15 h）。加酶標(biāo)Ⅱ抗，37℃孵育30 min。每一步操作之間均以0.01 mol/L PBS液沖洗3 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組獨(dú)立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTB感染后小鼠肺組織PPARγ表達(dá)的變化

如圖1所示，對(duì)照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間PPARγ表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；MTB+ROZ組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)顯著高于MTB組，MTB+GW9662組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)則較MTB組顯著降低（P＜0.05）。

Figure 1.Expression of PPARγat mRNA and protein levels in the lung tissue of mice in each group.A：the mRNA expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group；B：the protein expression of PPARγin the lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MTBgroup.圖1 各組小鼠肺組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)

2 各組小鼠肺組織脂質(zhì)水平

油紅O染色結(jié)果顯示，MTB組小鼠肺組織可見少量橙紅色脂滴；MTB+ROZ組小鼠肺組織內(nèi)橙紅色脂滴彌漫分布，較單純MTB組明顯增多；而MTB+GW9662組小鼠肺組織內(nèi)脂滴數(shù)量較MTB組明顯減少，見圖2。

Figure 2.Lipid level in the lung tissue of mice in each group（Oil red Ostaining，×400）.圖2 各組小鼠肺組織脂質(zhì)水平

3 各組小鼠肺組織荷菌量的比較

如圖3所示，MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間肺組織荷菌量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.247，P＜0.05）。與MTB組比較，MTB+ROZ組小鼠肺組織荷菌量明顯升高（6.20±0.58vs6.92±0.21，P＜0.05）；MTB+GW9662組小鼠肺組織荷菌量明顯降低（6.20±0.58vs5.50±0.49，P＜0.05）。

Figure 3.Bacterial load in lung tissue of mice in each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MTB group.圖3 各組小鼠肺組織荷菌量

4 肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)（r=0.812，P＜0.01），見圖4。

Figure 4.The correlation between PPARγexpression and bacterial load.Mean±SD.n=3.圖4 小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量相關(guān)性

5 各組小鼠肺組織CD36表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，CD36鏡下觀察為棕褐色沉淀。CD36在MTB組呈中等表達(dá)，在MTB+ROZ組呈高表達(dá)，而在對(duì)照組和MTB+GW9662組不表達(dá)和呈低表達(dá)，見圖5。這表明PPARγ活化能夠增加CD36的表達(dá)，而拮抗PPARγ活性則抑制CD36的表達(dá)。

Figure 5.Expression of CD36 in lung tissue of mice in each group（×400）.圖5 各組小鼠肺組織CD36表達(dá)

6 各組小鼠血漿脂質(zhì)濃度

如圖6所示，對(duì)照組、MTB組、MTB+ROZ組及MTB+GW9662組之間TC、TG、LDL-C及HDL-C的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MTB組小鼠血漿脂質(zhì)水平均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；與單純MTB感染組相比，感染的同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和PPARγ拮抗劑GW9662，血漿脂質(zhì)水平分別表現(xiàn)為明顯下降（P＜0.05）和升高（P＜0.05）。

7 各組小鼠肺組織病理變化

MTB組及MTB+ROZ組小鼠肺組織鏡下均可見肺泡壁增厚、肺組織壞死和出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，后者可見肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)粉紅色滲出液，提示病變更為嚴(yán)重；MTB+GW9662組小鼠肺組織鏡下雖然亦可見組織壞死及出血，但病變較輕，見圖7。

討 論

MTB侵入人體后，肺泡巨噬細(xì)胞是抵御細(xì)菌感染的第一道防線［13］。PPARγ在肺泡巨噬細(xì)胞的高表達(dá)，在結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。本課題組前期研究顯示，結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞PPARγ表達(dá)高于健康對(duì)照組［14］。從本研究結(jié)果來(lái)看，MTB感染小鼠后，對(duì)肺組織造成了一定的結(jié)核性損傷，PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高。本研究亦對(duì)肝臟和脾臟進(jìn)行了組織病理學(xué)檢測(cè)，僅顯示輕度炎癥反應(yīng)，肝、脾組織PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（結(jié)果未在文中列出）。進(jìn)一步證實(shí)PPARγ與結(jié)核病發(fā)病存在一定的關(guān)系。

Figure 6.Lipid concentration in plasma of mice in each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MTBgroup.圖6 各組小鼠血漿脂質(zhì)濃度

Figure 7.Pathological changes of the lung tissue of mice in each group（left：×40；right：×200）.A：control group；B：MTB group；C：MTB+ROZ group；D：MTB+GW9662 group.圖7 各組小鼠肺組織病理變化

MTB感染期間，慢性炎癥的一個(gè)重要特征是由MTB所誘導(dǎo)的泡沫巨噬細(xì)胞的積累，這是破壞巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的因素之一，而這些脂質(zhì)的聚集會(huì)影響宿主對(duì)感染或細(xì)菌清除的反應(yīng)，并且為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)［15］。結(jié)核病患者的干酪性結(jié)核肉芽腫中表現(xiàn)出過(guò)多的宿主脂質(zhì)代謝基因表達(dá)上調(diào)［16］，導(dǎo)致組織中脂質(zhì)蓄積。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)了結(jié)核病患者PPARγ表達(dá)的增加與其血漿脂質(zhì)水平的變化具有一定的關(guān)系［14］。本研究結(jié)果顯示，MTB感染小鼠肺組織中可見紅色脂滴形成。有研究報(bào)道，MTB感染后通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞泡沫化，繼之抑制巨噬細(xì)胞膜的修復(fù)功能，最終導(dǎo)致其破裂壞死，釋放胞內(nèi)脂質(zhì)成分而形成干酪樣壞死［17］，因而推測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞可能是MTB感染肺組織脂質(zhì)的重要來(lái)源。MTB+ROZ組肺組織內(nèi)橙紅色脂滴彌漫分布，較單純MTB組明顯增多，MTB+GW9662組肺組織內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少?？梢?，PPARγ的活化能夠加劇MTB所誘導(dǎo)的脂質(zhì)聚集，而PPARγ拮抗劑GW9662則對(duì)MTB所致的脂質(zhì)聚集具有逆轉(zhuǎn)作用，表明PPARγ在結(jié)核病相關(guān)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮了重要的作用。

Knight等［18］認(rèn)為，MTB特異性地激發(fā)脂滴的形成，是一種致病策略，目的是建立宿主脂質(zhì)庫(kù)，作為碳源來(lái)促進(jìn)自身在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)。MTB優(yōu)先利用脂質(zhì)促進(jìn)多種代謝功能，包括能量合成，毒力因子表達(dá)，細(xì)胞壁和外膜構(gòu)建，為自身在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)提供有益條件［11］。本研究對(duì)小鼠肺組織荷菌量檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純感染MTB相比較，同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑，小鼠肺組織荷菌量明顯升高，PPARγ拮抗劑則可降低肺組織荷菌量。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)與荷菌量呈正相關(guān)，也從另一個(gè)角度說(shuō)明了，PPARγ的抑制所致的脂滴耗竭能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)MTB的清除。

CD36作為一種識(shí)別氧化脂質(zhì)或氧化凋亡蛋白的B型清道夫受體［19］，介導(dǎo)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬作用和炎癥對(duì)各種病原體（包括MTB）的反應(yīng)。MTB感染能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD36的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ介導(dǎo)的脂質(zhì)積聚與麻風(fēng)病皮損內(nèi)巨噬細(xì)胞中CD36表達(dá)增加呈正相關(guān)［20］。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）可以通過(guò)激活PPARγ誘導(dǎo)CD36表達(dá)［21］。本研究結(jié)果顯示，小鼠肺組織CD36在單純MTB感染組呈中等表達(dá)，而在感染的同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮，CD36則呈高表達(dá)，PPARγ拮抗劑GW9662則降低了CD36表達(dá)，證實(shí)了CD36表達(dá)確實(shí)與PPARγ活化有關(guān)。正常情況下，體內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞可通過(guò)CD36攝取LDL之間的協(xié)作來(lái)維持胞內(nèi)脂質(zhì)的平衡［16］。正是MTB感染上調(diào)了PPARγ的表達(dá)，導(dǎo)致下游信號(hào)CD36對(duì)脂質(zhì)的過(guò)度攝取，引起外源性脂質(zhì)的流入增加，因而導(dǎo)致MTB感染小鼠肺組織脂質(zhì)水平的變化?？梢?，MTB感染過(guò)程中，PPARγ可通過(guò)調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)吸收的CD36表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累［22］，但并不排除PPARγ介導(dǎo)的脂質(zhì)積聚還與其他清道夫受體，如巨噬細(xì)胞清道夫受體（macrophage scavenger receptor，MSR）、具有膠原結(jié)構(gòu)的巨噬細(xì)胞受體（macrophage receptor with collagenousstructure，MARCO）等表達(dá)有關(guān)。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌依賴機(jī)體的脂類來(lái)決定其存活或增殖，因此其感染后誘導(dǎo)的機(jī)體脂代謝下調(diào)是該病原菌致病的主要特點(diǎn)。血液中脂質(zhì)水平的降低被認(rèn)為會(huì)加速肺部疾病的發(fā)展，而且是傳染病的主要危險(xiǎn)因素［23-25］。本研究檢測(cè)血漿TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度，結(jié)果顯示PPARγ表達(dá)增加或其活化反而降低血脂水平，與PPARγ活化致肺組織脂質(zhì)增加相反。有理論認(rèn)為MTB感染產(chǎn)生過(guò)氧化作用，可能導(dǎo)致血脂濃度降低和組織炎癥［23］。此外，CD36能夠參與和增加對(duì)外源性脂質(zhì)的攝取［26］，推測(cè)血脂降低與PPARγ誘導(dǎo)的CD36表達(dá)亦存在一定的關(guān)系。

宿主脂質(zhì)在MTB細(xì)胞壁和胞內(nèi)內(nèi)含物中積累是MTB維持毒力所必需的［27］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肺組織病理學(xué)觀察顯示，MTB感染過(guò)程中，PPARγ活化會(huì)導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的病理?yè)p傷，而這種損傷伴隨著組織中脂滴的積聚，細(xì)菌數(shù)量的增加以及系統(tǒng)性血清脂質(zhì)的損耗。因而脂質(zhì)代謝異常對(duì)MTB感染和疾病進(jìn)展具有一定的促進(jìn)作用。

總之，本研究探討了PPARγ通過(guò)CD36途徑在MTB感染小鼠脂質(zhì)代謝中的作用，闡明了MTB誘導(dǎo)的PPARγ表達(dá)所導(dǎo)致的脂質(zhì)聚集能夠影響宿主對(duì)細(xì)菌的清除［28］，有助于MTB在體內(nèi)的存活和復(fù)制，這對(duì)MTB來(lái)說(shuō)是一種逃逸宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制。從而提示PPARγ和CD36作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有望成為遏制結(jié)核病進(jìn)展的候選靶標(biāo)。