益腎通絡(luò)方對大鼠勃起功能障礙及NO-cGMP通路的影響*

李 勛，陳建設(shè)，門 波，李 暉，陳 翔，張 輝，郝高利，樊立鵬，董亞洲

［河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）生殖男科，河南鄭州450002］

勃起功能障礙（erectiledysfunction，ED）是一種常見的男性性功能障礙疾病，患者陰莖不能持續(xù)達(dá)到或維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，不僅影響男性生育能力，也極大威脅其心理及精神健康［1-2］。一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷（nitric oxide-cyclic guanosine momophosphate，NO-cGMP）通路是調(diào)控陰莖勃起的主要信號，NO作為產(chǎn)生和維持陰莖勃起的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，由一氧化氮合成酶（nitric oxidesynthetase，NOS）在催化下生成，當(dāng)其生成減少時(shí)，cGMP水平降低，血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙受阻，從而抑制陰莖的勃起；激活NO-cGMP信號通路，則可改善ED臨床癥狀［2-4］。ED在中醫(yī)理論中屬于“陽痿”，腎陽虧虛、血瘀脈絡(luò)是其主要病機(jī)，補(bǔ)腎壯陽、活血通絡(luò)是ED主要的治療手段［5］。益腎通絡(luò)方（Yishentongluo decoction，YSTL）是治療男性不育的經(jīng)驗(yàn)方，可溫腎助陽、益氣活血、散結(jié)通絡(luò)，抑制生精細(xì)胞凋亡，提高精索靜脈曲張不育癥患者生精能力，并對肝郁腎虛型ED患者臨床療效顯著［6-7］。但益腎通絡(luò)方對ED大鼠NO-cGMP通路的影響目前還不清楚，本文通過建立ED大鼠模型，對此進(jìn)行探索。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SD大鼠，許可證號為SYXK（粵）2018-0193，深圳康泰生物制品股份有限公司，體重200～240 g。飼養(yǎng)條件：12 h/12 h交替光暗，溫度25℃，濕度55%左右，大鼠自由飲食、飲水，動物房環(huán)境保持安靜、通風(fēng)良好。

1.2 試劑與儀器益腎通絡(luò)方（丹參30 g、淫羊藿20 g、菟絲子20 g、黃芪20 g、川牛膝10 g、熟地黃10 g和水蛭6 g為1劑）購自康仁堂藥業(yè)有限公司；己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）購自Sigma；西地那非（sildenafil）片（國藥準(zhǔn)字：H20020526）購自美國輝瑞公司；阿撲嗎啡購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司；睪酮放射免疫測定試劑盒購自天津協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司；大鼠cGMPELISA試劑盒，兔源抗NOS、鳥苷酸環(huán)化酶（guanosine cyclase，GC）和GAPDH的Ⅰ抗，以及羊抗兔Ⅱ抗購自Abcam；NOSELISA試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；NOELISA試劑盒購自濰坊祺翔生物科技有限公司；RIPA裂解液和BCA試劑盒購自碧云天。ELx800酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；MP150生理儀購自BIOPAC；H6080放免儀購自Carl Zeiss；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)購自Eppendorf；1659001蛋白電泳儀和Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad；GIS-500凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司。

2 方法

2.1 大鼠模型制備及分組給藥取SD大鼠，將DES溶于生理鹽水中，以5 mg/kg［8］腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射8周后，檢測大鼠血清睪酮水平，并進(jìn)行阿撲嗎啡誘導(dǎo)勃起實(shí)驗(yàn)，當(dāng)大鼠血清睪酮水平（71.08±9.86）相比對照組大鼠（335.17±30.12）明顯降低，且在30 min內(nèi)勃起次數(shù)為0時(shí)，表明建模成功，共建模63只，成功60只，隨機(jī)分為模型（model）組、益腎通絡(luò)方低（YSTL-low）、中（YSTL-medium）、高（YSTL-high）劑量組和西地那非（sildenafil）組，每組12只，另取12只SD大鼠，腹腔注射等劑量生理鹽水，設(shè)定為對照組。取益腎通絡(luò)方2劑，加水煎煮，過濾得到生藥濃度為2.32 g/mL的藥液100 mL，以生理鹽水稀釋，獲得濃度為0.58、1.16和2.32 g/mL的藥液，益腎通絡(luò)方各劑量組以10 mL/kg［9］灌胃，使終劑量分別為5.8、11.6和23.2 g/kg，西地那非溶于生理鹽水中，制備為0.5 mg/mL的溶液，以10 mL/kg的劑量［10］灌胃，使終劑量為5 g/kg，模型組和對照組以10 mL/kg的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)用藥4周。

2.2 阿撲嗎啡誘導(dǎo)勃起實(shí)驗(yàn)以阿撲嗎啡試驗(yàn)檢測大鼠勃起功能［11］：末次給藥24 h后，將大鼠放置在安靜、昏暗的環(huán)境下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前，先讓動物適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境1 h，于頸部皮下注射阿撲嗎啡，劑量為100 μg/kg，然后觀察大鼠陰莖勃起情況，記錄30 min內(nèi)勃起次數(shù)及勃起潛伏期，取其平均值。陰莖勃起標(biāo)志：大鼠龜頭充血、陰莖體增長并露出，有時(shí)伴有射精、彎腰舔食陰莖及打哈欠等動作。勃起潛伏期：從阿撲嗎啡注射結(jié)束至大鼠出現(xiàn)第1次陰莖勃起之間所用的時(shí)間，若30 min內(nèi)大鼠未勃起，則勃起潛伏期為30 min。

2.3 大鼠最大陰莖海綿體內(nèi)壓（maximum intracavernous pressure，Max ICP）/平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）的檢測勃起實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，通過電刺激海綿體神經(jīng)，使陰莖海綿體充血勃起，參數(shù)為電流5 mA，頻率50 Hz，脈沖寬度61.66 ms，持續(xù)60 s，以生理儀連續(xù)監(jiān)測ICP及MAP，計(jì)算Max ICP/MAP值。

2.4 大鼠血清睪酮水平、陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平的測定2.3中的檢測結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血2 mL，靜置后4℃、3 000 r/min離心，取上清液，得到血清備用，然后吸入乙醚麻醉大鼠后處死，分離陰莖組織，剪取約3 g，剪碎后加入蛋白裂解液，以勻漿機(jī)制備為勻漿液，4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液，參照試劑盒說明書，以BCA法測定其中蛋白總濃度，血清及蛋白樣品液各取500 μL，采用試劑盒分別測定血清中睪酮水平、陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，剩余蛋白樣品液進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測。

2.5 大鼠陰莖組織中NOS和GC蛋白表達(dá)的測定各組分別取含20μg總蛋白的2.4中剩余的樣品液，上樣，進(jìn)行電泳，然后濕轉(zhuǎn)，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%牛奶溶液封閉后（室溫孵育2 h），分別以兔源抗GAPDH、NOS、GC的Ⅰ抗溶液孵育過夜（4℃），稀釋比例均為1∶2 000，TBST溶液漂洗3次，以稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔Ⅱ抗溶液孵育2 h（室溫），TBST溶液漂洗3次，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，使用凝膠成像儀對條帶拍照，并采用ImageJ軟件分析圖像，得出蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 益腎通絡(luò)方對大鼠勃起功能的影響

與對照組比較，模型組大鼠勃起次數(shù)明顯降低（P＜0.05），勃起潛伏期明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠勃起次數(shù)升高（P＜0.05），勃起潛伏期降低（P＜0.05），且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠勃起功能、Max ICP/MAP和血清睪酮水平的變化Table 1.Erectile function，Max ICP/MAPand serum testosterone levels in each group（Mean±SD.n=12）

2 益腎通絡(luò)方對大鼠Max ICP/MAP的影響

與對照組比較，模型組大鼠Max ICP/MAP明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠Max ICP/MAP升高（P＜0.05），且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

3 益腎通絡(luò)方對大鼠血清睪酮的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清睪酮水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠血清睪酮水平升高（P＜0.05），且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

4 益腎通絡(luò)方對大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平升高（P＜0.05），且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表2。

5 益腎通絡(luò)方對大鼠陰莖組織中NO-cGMP通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠陰莖組織中NOcGMP通路相關(guān)蛋白NOS和GC蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方低、中、高劑量組和西地那非組大鼠陰莖組織中NOS和GC蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），且益腎通絡(luò)方各組之間呈劑量依賴性（P＜0.05）；益腎通絡(luò)方高劑量組與西地那非組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖1、表2。

討 論

ED的病因復(fù)雜多樣，生理及心理等多方面因素涉及其中，睪酮水平低下是其主要病因之一，肢端肥大癥、甲狀腺疾病、垂體功能減退等均可影響性腺功能，減少睪酮生成，繼而引發(fā)ED，DES作為一種非甾體合成雌激素，可破壞睪丸引帶細(xì)胞的形態(tài)，抑制其增殖，損傷男性生殖系統(tǒng)功能，可用來構(gòu)建ED動物模型［8，12-14］。本文通過腹腔注射DES的方法建立ED大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠勃起次數(shù)、Max ICP/MAP、血清睪酮水平明顯降低，勃起潛伏期明顯升高，表明DES可影響睪酮合成，降低其血清水平，損傷大鼠陰莖勃起功能，造成ED，揭示模型建立成功。

表2 各組大鼠陰莖組織中NOS活性、NO/cGMP含量和NOS/GC蛋白水平的變化Table 2.NOSactivity，NO/cGMPcontent and NOS/GCprotein levels in penile tissue in each group（Mean±SD.n=12）

Figure 1.The expression of NO-cGMPpathway-related proteins in penile tissue of rats in each group was determined by Western blot.A：control group；B：model group；C：YSTL-low group；D：YSTL-medium group；E：YSTL-high group；F：sildenafil group.圖1 Western blot檢測各組大鼠陰莖組織中NO-cGMP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

臨床治療ED以對癥治療為主，藥物常采用磷酸二酯酶抑制劑，西地那非作為一種選擇性磷酸二酯酶抑制劑，在臨床中得到廣泛應(yīng)用，但其對部分患者療效不佳，并且存在較多副作用，中醫(yī)藥治療可標(biāo)本兼治，其毒副作用小，具有明顯優(yōu)勢［7，15-16］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ED即為“陽痿”，腎藏精，內(nèi)寓真陽，主生殖，是先天為之本，若元陽虧損，腎精不足，可導(dǎo)致推動和滋養(yǎng)不足，精血運(yùn)行受阻，瘀血積聚，因而腎精虧損為本，血瘀阻絡(luò)是標(biāo)，是ED的重要病機(jī)。益腎通絡(luò)方是治療腎精虧虛的經(jīng)典方劑，方中川牛膝、丹參能通絡(luò)活血，淫羊藿能補(bǔ)助腎陽，菟絲子能填精益腎，黃芪能升陽補(bǔ)氣，熟地黃能補(bǔ)髓生精，水蛭能通經(jīng)化瘀，諸藥合用具有補(bǔ)腎生精，化瘀通絡(luò)的功效，對男性不育癥、性功能障礙等疾病具有較好的療效［17-19］。本文結(jié)果顯示，以益腎通絡(luò)方處理ED模型大鼠，可升高大鼠勃起次數(shù)、Max ICP/MAP、血清睪酮水平，降低勃起潛伏期，且呈劑量依賴性，表明益腎通絡(luò)方可增強(qiáng)睪酮合成，促使血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙，升高陰莖海綿體內(nèi)壓，改善陰莖勃起功能，進(jìn)一步證實(shí)益腎通絡(luò)方對ED具有治療作用，但其藥理機(jī)制目前還不清楚。

研究證明，NO-cGMP通路在引起并維持陰莖勃起中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，NO作為一種內(nèi)源性信號分子，由NOS催化產(chǎn)生，可通過激活GC，把GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，作用于鈣離子通道，松弛平滑肌，促使血液進(jìn)入陰莖動脈和海綿竇間隙，引起陰莖勃起［3-4］。另外，研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)睪酮合成，可激活NO-cGMP信號，增加血清NO含量，顯著改善ED男性性功能，由此可知NO-cGMP是調(diào)控睪酮水平，改善ED臨床癥狀的重要作用靶點(diǎn)［20-21］。本文結(jié)果顯示，ED模型大鼠陰莖組織中NOS活性及NO、cGMP水平、陰莖組織NOS和GC蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)益腎通絡(luò)方治療后，其陰莖組織中NOS活性及NO和cGMP水平、陰莖組織NOS和GC蛋白表達(dá)升高，且呈劑量依賴性，表明NO-cGMP信號參與睪酮合成的調(diào)控及ED的發(fā)病過程，益腎通絡(luò)方可活化該信號通路，增強(qiáng)睪酮的合成，改善ED癥狀。

綜上所述，益腎通絡(luò)方可上調(diào)NOS和GC蛋白表達(dá)，提高陰莖組織中NO和cGMP水平，增強(qiáng)睪酮合成，促使血液流入陰莖，升高陰莖海綿體內(nèi)壓，修復(fù)陰莖勃起功能，激活NO-cGMP信號可能是其藥理機(jī)制。但本文只進(jìn)行了初步研究，證據(jù)還不充足，需以NOcGMP通路激動劑和抑制劑做對照驗(yàn)證，進(jìn)而對益腎通絡(luò)方治療ED的藥理機(jī)制進(jìn)行充分深入的闡釋。