基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討枸杞子-山藥防治阿爾茨海默病的作用機(jī)制

楊 夢(mèng)，鮮慈英，黃 斌，凌志峰，趙 倩，詹 杰，羅洪斌,2,3*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000)

2.湖北民族大學(xué)神經(jīng)精神共患病研究所(湖北 恩施 445000)

3.湖北恩施學(xué)院(湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一種與年齡相關(guān)的、進(jìn)行性的、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病，以認(rèn)知和記憶障礙為特征，是老年癡呆的最常見疾病[1]，主要病理改變是以細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和細(xì)胞外的老年斑形成[2]。2015年世界AD報(bào)告指出[3]，全球每3 s有1例新發(fā)AD患者被診斷，到2050年，全球老年癡呆患者將從目前4 600萬(wàn)人增加至1.315億。AD歸屬為中醫(yī)學(xué)中老年癡呆的范疇，以補(bǔ)腎益智、調(diào)養(yǎng)五臟為主要的治療原則。枸杞子(lycium barbarum)是茄目茄科枸杞屬植物，又名“卻老子”，具有補(bǔ)肝益腎、益精明目等功效。枸杞子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，稱其為“久服輕身不老、耐寒暑”[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，枸杞子主要活性成分有枸杞多糖、多酚和類胡蘿卜素等，具有抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、抗AD、抗氧化和保肝等作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，枸杞子可增加AD小鼠自主活動(dòng)試驗(yàn)中的水平和垂直運(yùn)動(dòng)量，提高旋轉(zhuǎn)木馬試驗(yàn)中的耐力時(shí)間并降低Morris水迷宮試驗(yàn)中的逃逸潛伏期。枸杞子被證實(shí)能改善AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能，且在延緩衰老相關(guān)認(rèn)知障礙和改善健康方面具有強(qiáng)大潛力[7]。山藥(chinese yam)為薯蕷科薯蕷屬多年生纏繞性藤本薯蕷的根莖，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺等功效。研究發(fā)現(xiàn)[8]山藥含有豐富的蛋白質(zhì)、人體必需的氨基酸、多種微量元素、多糖、膽堿、甾醇等多種營(yíng)養(yǎng)成分及功能因子，其中，多糖是其主要成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤等功效。張松峰等[9]報(bào)道認(rèn)為山藥、枸杞子為主的藥對(duì)是符合藥食同源類中藥從虛防治AD的基本食療配伍規(guī)律并在臨床得到廣泛應(yīng)用。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出枸杞子-山藥的有效成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，進(jìn)一步明確其防治AD的作用機(jī)制，為AD的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1枸杞子、山藥化學(xué)成分査詢及篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP：Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中査詢枸杞子、山藥組分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%且類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步篩選[10]。其中，OB是影響藥效的關(guān)鍵因素，它反映了藥物經(jīng)吸收進(jìn)入循環(huán)血液的量，OB≥30%說(shuō)明藥物有較好吸收。DL是指化合物與已知藥物的相似性，DL≥0.18說(shuō)明化合物有較好的成藥可能性。

1.2基因標(biāo)準(zhǔn)化通過(guò)Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換成基因名，選擇人源靶蛋白。

1.3收集疾病基因在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Alzheimer’s disease”作為關(guān)鍵詞查找與AD相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.4網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制疾病-藥物-靶點(diǎn)-基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。利用STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，然后利用R×64 3.6.3及Perl腳本構(gòu)建枸杞子-山藥防治AD的PPI核心靶點(diǎn)基因。

1.5生物功能和富集功能分析利用R×64 3.6.3及Perl腳本進(jìn)行程序運(yùn)算，對(duì)篩選出的基因做GO分析和KEGG分析。

2 結(jié)果

2.1枸杞子、山藥化學(xué)成分篩選共篩選出枸杞子的候選化合物96個(gè)，山藥的37個(gè)，它們分別具有444、190個(gè)靶點(diǎn)，見表1。

表1 枸杞子-山藥化合物的基本信息

2.2收集疾病靶點(diǎn)以及候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與AD相關(guān)基因，共8 718個(gè)基因，后取Relevance score≥17進(jìn)行篩選。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，去除非人源靶蛋白后，共得到506個(gè)基因。

2.3構(gòu)建疾病-藥物-靶點(diǎn)-基因網(wǎng)絡(luò)將疾病與靶點(diǎn)取交集，共取得79個(gè)交集基因。據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件作圖結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)由111個(gè)節(jié)點(diǎn)組成，包括29個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、79個(gè)基因節(jié)點(diǎn)、2個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)及1個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)，見圖1。此外，排名前5位的分別是槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、蕓香素(rutin)、黃豆素黃酮(glycitein)、薯蕷皂甙元(diosgenin)等，這些有效成分可能是枸杞子-山藥防治AD的最關(guān)鍵成分。

注：紅色節(jié)點(diǎn)：疾??；淺綠色節(jié)點(diǎn)：藥物；深綠色節(jié)點(diǎn)：基因；紫色：成分

2.4構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖及PPI核心靶點(diǎn)圖將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為人，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。在GQZ-SY防治AD的PPI核心靶點(diǎn)基因圖中，INS、AKT1、CASP3、IL6、MAPK1、TNF是關(guān)聯(lián)度值最大的前6個(gè)節(jié)點(diǎn)，這6個(gè)節(jié)點(diǎn)可能是GQZ-SY防治AD的重要靶點(diǎn)，可能在防治AD中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見圖3。

圖2 GQZ-SY防治AD的PPI基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

注：數(shù)字=節(jié)點(diǎn)度

2.5生物功能和通路富集分析將GQZ-SY防治AD可能發(fā)揮作用的基因靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析及KEGG分析，見圖4-5。在GO分析中得到GQZ-SY作用于AD條目2 355個(gè)，其中生物過(guò)程(Biological Process，BP)條目2 167個(gè)，分子功能(Cellular Component，CC)條目62個(gè)，細(xì)胞組分(Molecular Function，MF)條目125個(gè)。BP涉及了活性氧代謝過(guò)程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、外源性凋亡信號(hào)通路、活性氧物種生物合成過(guò)程等。CC涉及了膜微區(qū)、膜區(qū)等。MF涉及了磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等。

圖4 GQZ-SY防治AD的GO功能富集分析柱狀圖

圖5 GQZ-SY防治AD的KEGG通路富集分析柱狀圖

KEGG分析得出MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，其中，MAPK信號(hào)通路是與AD機(jī)制研究密切相關(guān)的通路，也可能是GQZ-SY通過(guò)其發(fā)揮作用改善認(rèn)知功能障礙的重要信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路包含了經(jīng)典的MAPK通路、c-Jun N端激酶(JNK)和P38 MAPK通路、蛋白激酶5(ERK5)通路，本次研究所涉及到的蛋白有胱天蛋白酶(CASP)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、人體抑癌基因(P53)、P38蛋白(P38)、蛋白激酶C(PKC)、TNF等，見圖6。

圖6 MAPK信號(hào)通路

3 討論

關(guān)于AD的研究有Tau蛋白過(guò)度磷酸化假說(shuō)、Aβ沉積假說(shuō)、炎癥假說(shuō)、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)假說(shuō)、基因突變假說(shuō)等，然而這些假說(shuō)尚不能夠清晰解釋該病的發(fā)病機(jī)理。AD的發(fā)生與年齡、性別、教育等因素息息相關(guān)，同時(shí)伴隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，患病人數(shù)日益增加，因此亟待開發(fā)可有效防治AD的藥物。

王翠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅對(duì)原代培養(yǎng)的初生大鼠海馬和皮層神經(jīng)元具有雌激素樣保護(hù)作用，還可拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制下游靶分子GSK3β活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。富含β-谷甾醇的食物，可有效預(yù)防AD的發(fā)生[12]。薯蕷皂甙元能顯著改善個(gè)體動(dòng)物的認(rèn)知能力，有效減少大腦皮層和海馬的淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)，并有效拮抗僅在淀粉樣斑塊密切相關(guān)區(qū)域觀察到的退化軸突和突觸前終末的減少[13]。CASP3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。IL-6是另一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、參與免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能，并在機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出殺瘤或抑瘤作用和免疫調(diào)節(jié)活性。GQZ-SY防治AD的生物過(guò)程主要有活性氧代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、外源性凋亡通路等。神經(jīng)元凋亡是AD的主要特征之一，半胱天冬酶與神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成呈正相關(guān)[14]，半胱天冬酶一旦被激活，便可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度凋亡。

MAPK信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過(guò)程。MAPK家族的信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(ERK)、JNK/應(yīng)激激活的蛋白激酶(SAPK)、P38 MAPK以及蛋白激酶5/大絲裂原活化蛋白激酶1(ERK5/BMK1)4條途徑[15]。MAPK通路與神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等均有關(guān)系[1]。p38 MAPK抑制劑可保護(hù)血管性癡呆大鼠的行為學(xué)能力和形態(tài)結(jié)構(gòu)并調(diào)控腦海馬區(qū)多種氨基酸的表達(dá)[16]。其中，ERK指導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生遷移和神經(jīng)祖細(xì)胞的最終命運(yùn)，參與樹突的成熟過(guò)程和突觸形成、行為學(xué)以及記憶過(guò)程。PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、自噬等過(guò)程，與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切，而AKT、GSK-3β是這條通路上重要的靶標(biāo)蛋白，正確調(diào)控它們的表達(dá)，有助于保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育。

課題組后續(xù)可參考本次預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步挖掘GQZ-SY防治AD的作用機(jī)制，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持并推動(dòng)臨床應(yīng)用。本研究尚存在一定的局限性，研究策略差異、數(shù)據(jù)庫(kù)收納信息、再加上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分研究有忽略中藥成分的含量和濃度問(wèn)題等，均會(huì)產(chǎn)生預(yù)測(cè)結(jié)果的不同。

綜上所述，GQZ-SY可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路間的相互影響、相互協(xié)同而發(fā)揮防治AD的作用，多與保護(hù)神經(jīng)元、減輕炎癥反應(yīng)、參與免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)。