PEG-Asp對(duì)Ph陰性成人急性淋巴細(xì)胞白血病患者臨床療效及Notch1、ASB2基因表達(dá)的影響

聶盼盼，李倩娟，陳晨晨

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南 洛陽(yáng) 471000；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南 洛陽(yáng) 471000）

急性淋巴細(xì)胞白血病屬于淋巴造血惡性腫瘤疾病的一種，其起源于B造血祖細(xì)胞和T造血祖細(xì)胞，根據(jù)2012年全國(guó)腫瘤登記中心報(bào)道[1]，目前，惡性淋巴腫瘤發(fā)病率為5.1/10萬(wàn)，在所有惡性腫瘤中順位第8位。臨床上，治療急性淋巴細(xì)胞白血病的主要藥物包括三種：來(lái)自于大腸埃希菌的左旋門冬酰胺酶（L-asparaginase, L-Asp），來(lái)自于歐文菌的L-Asp，以及來(lái)自于大腸埃希菌的聚乙二醇化門冬酰胺酶（PEG-Asp）[2]。源于歐文菌的L-Asp的短效性，臨床限制了其的使用，而來(lái)自大腸埃希菌的L-Asp屬于異源性蛋白，其在臨床使用中常出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)，所以臨床使用較為限制。而PEG-Asp是我國(guó)自主研發(fā)的新型門冬酰胺酶制劑，在制作工藝中，對(duì)L-Asp的免疫原性進(jìn)行大幅降低，同時(shí)對(duì)其藥理活性進(jìn)行了大規(guī)模保留，臨床療效中效果良好[3]。研究[4]顯示，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Notch1）信號(hào)參與了淋巴細(xì)胞成熟的多個(gè)階段，其信號(hào)的表達(dá)與急性淋巴細(xì)胞白血病的形成密切相關(guān)。細(xì)胞信號(hào)抑制因子盒蛋白2（ankyrin-repeat SOCS box contain protein, ASB2）信號(hào)通路與蛋白泛素化作用有關(guān)，參與了急性淋巴細(xì)胞白血病的形成。本文采用PEGAsp治療Ph陰性成人急性淋巴細(xì)胞白血病，探究其臨床療效及對(duì)Notch1、ASB2基因表達(dá)的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為本院2016年2月—2019年2月住院的Ph陰性成人急性淋巴細(xì)胞白血病患者60例，年齡集中在40～55 歲，平均年齡(49.12±1.78)歲，男性患者35 例，女性患者25 例，文化程度：小學(xué)及以下13 例，中學(xué)學(xué)歷18 例，大專學(xué)歷及以上29 例，婚姻狀態(tài)：已婚55 例，未婚5 例，急性淋巴細(xì)胞白血病風(fēng)險(xiǎn)分層：標(biāo)危11 例，高危49 例。所有患者均簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理學(xué)術(shù)委員會(huì)論證通過。利用隨機(jī)數(shù)字表，將患者分為觀察組和對(duì)照組，每組30 例，兩組患者一般資料之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（表1）

表1 兩組患者基線資料對(duì)比（例）

1.2 患者入選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合Ph陰性成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡均在14 歲以上；③所有患者均為首次治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他血液系統(tǒng)疾病；②無(wú)法溝通的患者；③伴有高血壓、糖尿病以及腫瘤史患者；④意識(shí)不清患者。

1.3 研究方法 觀察組患者使用VDPAP化療方案治療，注射用硫酸長(zhǎng)春地辛（山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20053020，4 mg/d，d1、8、15、21）；注射用鹽酸柔紅霉素（深圳萬(wàn)樂，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024361，30 mg/m2，d1-3，d15-16），PEG-Asp（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090015，2 500 IU/m2，d8、22），PEG-Asp使用過程中分為三個(gè)部位進(jìn)行肌肉注射。環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026196，750 mg/m2，d1、15）。地塞米松（辰欣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021969，10 mg/d，d1-14，5 mg/d，d15-28），28 d為1 個(gè)療程，治療2 個(gè)療程。對(duì)照組患者也使用VDPAP化療方案治療，將化療方案中的PEG-Asp使用L-Asp（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20065348，6 000 U/m2）進(jìn)行代替，d11、14、17、20、23、26，28 d為1 個(gè)療程，治療2 個(gè)療程。其后均采用相同的鞏固維持方案。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 兩組患者治療前后骨髓象和血象對(duì)比觀察：分別對(duì)兩組患者治療前和治療2 個(gè)療程后進(jìn)行骨髓象和血象檢查，觀察兩組患者的骨髓幼稚細(xì)胞比例、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、白蛋白含量（ALB）以及血紅蛋白含量（Hb）之間的差異。

1.4.2 兩組患者近期效果評(píng)價(jià)：效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：使用《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)患者的近期效果進(jìn)行評(píng)價(jià)?；颊吖撬瑁涸剂馨图?xì)胞＋幼淋巴細(xì)胞≤5%，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常，患者外周血：血紅蛋白：男性≥100 g/L，女性及兒童≥90 g/L；中性粒細(xì)胞絕對(duì)值≥1.5 ×109/L；血小板≥100 ×109/L；外周血白細(xì)胞分類中無(wú)白血病細(xì)胞，臨床無(wú)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)所致的癥狀和體征，生活正?；蚪咏t為完全緩解（CR）?；颊吖撬瑁?%＜原始淋巴細(xì)胞＋幼淋巴細(xì)胞≤20%，或臨床、血象中有1項(xiàng)未達(dá)完全緩解標(biāo)準(zhǔn)者則為部分緩解（PR）?；颊吖撬柙剂馨图?xì)胞＋幼淋巴細(xì)胞＞20%，臨床、血象均未見明顯改善則為未緩解（NR）。總有效率＝(PR＋CR)/總例數(shù)×100%。

1.4.3 兩組患者遠(yuǎn)期療效對(duì)比：分別對(duì)兩組患者治療結(jié)束后隨訪1 年，觀察兩組患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）以及生存期（OS）之間的差異。其中PFS以患者出現(xiàn)骨髓復(fù)發(fā)、骨髓外復(fù)發(fā)以及死亡為結(jié)局事件。

1.4.4 兩組患者Notch1 mRNA、ASB2 mRNA的表達(dá)情況對(duì)比：分別于治療前和治療2 個(gè)療程后，抽取患者5 mL骨髓，使用淋巴細(xì)胞分離液獲得單個(gè)核細(xì)胞，使用總RNA提取液1 mL混勻后，－80 ℃冷凍保存待檢?；颊逳otch1 mRNA、ASB2 mRNA的表達(dá)情況采用Western blotting方法進(jìn)行，對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增后，分別使用方正掃描儀對(duì)患者以上電泳結(jié)果進(jìn)行掃描，同時(shí)以Quantity One軟件對(duì)患者的電泳結(jié)果進(jìn)行灰度計(jì)算，以患者Notch1、ASB2與GAPDH條帶的相對(duì)吸光度值對(duì)患者的Notch1、ASB2水平進(jìn)行評(píng)估?；驍U(kuò)增采用real-time PCR擴(kuò)增技術(shù)，Notch1上游引物為5' CGACGCACAAGGTCTGTCTTCCA 3'，下游引物為5' CGGACTTGCCCAGGTCATCTAC3'，179 bp，ASB2上游引物為5'CGTGGTGCAGTT CTGTGAGT 3'，下游引物為5' GTGAGCC AGAGGTCTTGGAC 3'，186 bp。采用GREEN QPCR Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔct表示。

1.4.5 兩組患者不良反應(yīng)對(duì)比：分別對(duì)兩組患者治療過程中可能出現(xiàn)的過敏反應(yīng)、肝功能損害、胃腸道反應(yīng)、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）延長(zhǎng)等不良反應(yīng)進(jìn)行對(duì)比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 文中數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行匯總分析。其中計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，采用卡方檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后骨髓象和血象對(duì)比觀察 兩組患者治療前骨髓幼稚細(xì)胞百分比、WBC、PLT、ALB以及Hb之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且治療后，觀察組患者的骨髓幼稚細(xì)胞百分比、PLT、Hb、APTT均明顯高于對(duì)照組，觀察組患者WBC明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。（表2）

表2 兩組患者治療前后骨髓象和血象對(duì)比觀察（±s，n＝30）

表2 兩組患者治療前后骨髓象和血象對(duì)比觀察（±s，n＝30）

指標(biāo) 治療前 t P 治療后 t P對(duì)照組 觀察組 對(duì)照組 觀察組骨髓幼稚細(xì)胞百分比（%） 67.67±19.11 71.38±21.09 1.010 0.315 7.14±0.85 7.58±0.12 3.970 0.000 WBC（×109/L） 15.67±2.13 15.57±2.43 0.240 0.811 6.32±1.43 4.25±1.39 8.040 0.000 PLT（×109/L） 103.24±21.32 107.65±23.54 1.076 0.284 217.83±11.94 239.78±12.32 9.910 0.000 ALB（g/L） 37.12±19.17 37.43±17.91 0.092 0.927 38.24±17.09 39.24±17.89 0.313 0.755 Hb（g/L） 81.32±11.54 74.87±12.78 1.102 0.273 109.67±14.22 120.34±15.33 3.953 0.000 APTT（s） 34.23±1.56 34.54±1.78 1.015 0.312 36.32±1.09 37.67±1.22 6.392 0.000

2.2 兩組患者近期療效對(duì)比 通過6 個(gè)月的治療，觀察組患者的總有效率為90.00%，對(duì)照組患者的總有效率為75.00%，兩組患者療效之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 兩組患者療效對(duì)比[例(%)]

2.3 兩組患者遠(yuǎn)期療效對(duì)比 通過對(duì)患者的1 年隨訪，兩組患者均未發(fā)現(xiàn)失訪，且觀察組患者的PFS和OS均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

表4 兩組患者遠(yuǎn)期療效對(duì)比[例(%)]

2.4 兩組化療前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平比較 治療前，兩組患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療后，兩組患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平均有明顯下降，且觀察組患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。（表5）

表5 兩組化療前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n＝30）

表5 兩組化療前后Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n＝30）

分組 Notch1 mRNA t P ASB2 mRNA t P化療前 化療后 化療前 化療后觀察組 15.34±2.31 2.34±1.33 37.778 0.000 9.24±2.87 1.87±2.34 15.416 0.000對(duì)照組 15.22±2.11 11.35±1.21 12.324 0.000 9.09±2.76 5.36±2.43 7.857 0.000 t 0.297 38.815 0.292 8.013 P 0.767 0.000 0.771 0.000

2.5 兩組患者不良反應(yīng)對(duì)比 通過治療，觀察組患者發(fā)生不良反應(yīng)：肝功能異常、過敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)以及APTT延長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表6）

表6 兩組患者不良反應(yīng)對(duì)比[例(%)]

3 討論

急性淋巴細(xì)胞白血病好發(fā)于兒童，成人也多見。成人急性淋巴細(xì)胞白血病占該病的20%～25%，由于其疾病的早發(fā)階段外周血原始幼稚細(xì)胞較多，極易造成患者的神經(jīng)系統(tǒng)白血病，預(yù)后較差[8]。

急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)主要依賴于門冬酰胺，相比于正常人群，患者的門冬酰胺酶的活性較低，甚至無(wú)活性，必須依賴血漿合成，通過其分解作用，將血漿中的門冬酰胺分解為門冬氨酸，進(jìn)而達(dá)到抑制患者的急性淋巴細(xì)胞白血病的形成，進(jìn)而造成腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前，L-Asp和PEGAsp是較為常用的急性淋巴細(xì)胞白血病的一線化療藥物，顯著改善惡性淋巴瘤的生存率。本文研究結(jié)果顯示，觀察組患者的有效率明顯高于對(duì)照組，從患者的遠(yuǎn)期療效分析，觀察組患者的生存情況明顯優(yōu)于對(duì)照組。分析認(rèn)為，相比L-Asp，PEG-Asp具有較長(zhǎng)的半衰期(7±2)d[9]，臨床上只需一次給藥。同時(shí)PEG-Asp在到達(dá)腫瘤細(xì)胞前始終保持脂類狀態(tài)，避免在藥物到達(dá)靶器官之前被細(xì)胞分解，提高了藥物使用率，進(jìn)而增加療效[10]。梁家寶等[11]在對(duì)兩種門冬酰胺酶進(jìn)行治療成人急性淋巴細(xì)胞白血病的研究中也提到，PEG-Asp效果顯著，其安全性較好，與本文研究結(jié)果相互印證。

Notch1信號(hào)通路參與B淋巴細(xì)胞的生成，在Th2細(xì)胞中也有微調(diào)作用，早期研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路參與白血病的分化和發(fā)展，并且已經(jīng)有研究證實(shí)Noch1在B淋巴細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和T淋巴細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者的單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)升高，可以作為新型藥物治療靶標(biāo)，同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)Notch1參與泛素化[12]，激活編碼ASB2蛋白轉(zhuǎn)錄，且其基因表達(dá)與ASB2基因表達(dá)呈正相關(guān)性。本文研究結(jié)果顯示，經(jīng)過治療后，觀察組患者的Notch1 mRNA、ASB2 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，分析認(rèn)為PEG-Asp通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其生長(zhǎng)，提高了近期有效率，抑制了Notch1 mRNA和ASB2 mRNA的表達(dá)。Notch1是一個(gè)膜受體蛋白，與天冬氨酸酶催化亞基的活性相關(guān)，其含量的增高可能與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)相關(guān)，而ABS2的表達(dá)有研究顯示，其與患者的Notch1表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對(duì)患者的泛素化反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。陳將華等[13]在對(duì)HERV-K Np9基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)人急性T淋巴細(xì)胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)患者體內(nèi)門冬酰胺酶的抑制作用，有效抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對(duì)其后續(xù)通路表達(dá)進(jìn)行有效抑制，進(jìn)而達(dá)到治療效果，本文研究結(jié)果從側(cè)面反映了門冬酰胺酶制劑對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病治療的后續(xù)通路表達(dá)[14]，與文獻(xiàn)研究相互呼應(yīng)。

從安全性分析，觀察組患者的不良反應(yīng)發(fā)生率明顯低于對(duì)照組，分析認(rèn)為，L-Asp作為異源性蛋白，其半衰期相對(duì)較短，使用頻次較多，而PEGAsp去除大量的免疫原性，同時(shí)保留藥物作用，其對(duì)人體的安全性較好。

綜上所述，PEG-Asp對(duì)Ph陰性成人急性淋巴細(xì)胞白血病患者的近期療效和遠(yuǎn)期療效較好，同時(shí)通過對(duì)Notch1、ASB2基因表達(dá)通路的影響，抑制患者的門冬酰胺酶作用，降低患者腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和增殖，同時(shí)，其安全性較好，值得在臨床工作中推廣。