煙酰胺N甲基轉(zhuǎn)移酶在食管癌中的表達(dá)及機(jī)制研究

周嘉梁，吳 佳，黃建鋒，范 強(qiáng)，趙滌非

（江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤放療科，江蘇 無錫 214122）

根據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全球2018年癌癥約有1 810萬 例新發(fā)病例，960萬 例死亡病例，其中食管癌發(fā)病例數(shù)約為57.2萬 例，排第7位，死亡例數(shù)約為50.8萬 例，排第6位[1]。全球食管癌發(fā)病率最高的是東南亞、東亞地區(qū)，特別是我國(guó)的食管癌發(fā)病率在全球排前五。目前食管癌的發(fā)病機(jī)制不明確，因此提高食管癌的篩查技術(shù)，特別是腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)于食管癌的高效篩查具有重要促進(jìn)作用[2]。煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide N-methyltransferase, NNMT）是一種催化煙酰胺的N-甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠轉(zhuǎn)化機(jī)體內(nèi)的藥物及外源性化合物。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)NNMT在心臟、腎、胎盤等正常組織中低表達(dá)，而在腎癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的NNMT可能成為腫瘤預(yù)后及治療的有效預(yù)測(cè)因子。因此本研究推測(cè)NNMT在食管癌中也存在異常表達(dá)，并參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展，為證實(shí)此推測(cè)，本研究將通過免疫組化檢測(cè)本醫(yī)院食管癌患者中NNMT表達(dá)，并探討NNMT對(duì)EC9706食管癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本研究標(biāo)本取自2015年11月—2019年12月江南大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除、并經(jīng)病理確診為食管癌的84 例石蠟標(biāo)本，所有患者均有完整的臨床資料及隨訪資料，所有患者在術(shù)前均沒有接受過任何的化療，放療及生物治療等。男73 例，女11例；＜60 歲18 例，≥60 歲66 例，年齡43～74 歲，中位年齡62.6 歲。另外選取84 例相應(yīng)的距離癌組織＞4 cm 的正常組織作為對(duì)照。

1.2 試劑與儀器 EC9706食管癌細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒、Hoechst染色試劑盒均購(gòu)于南通碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9及甘油醛-3磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)于Thermo Fisher公司；CFX Connect?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.3 免疫組化法檢測(cè)NNMT表達(dá) 石蠟標(biāo)本包埋并切成5 μm厚度的切片，60 ℃烘烤后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度酒精脫水，微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2內(nèi)源性滅活，切片滴加NNMT一抗工作液、4 ℃孵育過夜，次日滴加生物素二抗工作液室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察蛋白染色情況。選取PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。NNMT陽(yáng)性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞漿，采用半定量積分法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判定[6]。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將EC9706食管癌細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染siRNA NC（對(duì)照組）及siRNA NNMT（siRNA組），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，取出培養(yǎng)板，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各復(fù)孔的吸光值。

1.5 Hoechst法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將EC9706食管癌細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染siRNA NC及siRNA NNMT，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)基并PBS洗滌3 次后，加入固定液固定10 min，PBS洗滌3 次，Hoechst染液染色15 min，PBS洗滌3 次，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋Materiel膠，并以400 μL/孔均勻平鋪于Transwell上室，去除氣泡，并于培養(yǎng)箱中孵育30 min待其凝固備用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，并取2 mL濃度為5 ×104個(gè)/mL的細(xì)胞于Transwell上室，Transwell下室加入3 mL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，Transwell板于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將上室取出，用棉簽將膜表面殘留擦去，吸取培養(yǎng)液，并用PBS清洗，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌，顯微鏡下觀察并拍照記錄，取4個(gè)視野細(xì)胞數(shù)平均值。

1.7 Realtime PCR法檢測(cè)NNMT mRNA含量 按照Trizol試劑盒提取RNA，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定mRNA濃度和純度，后根據(jù)HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算出各組NNMT mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Western blot檢測(cè)NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9表達(dá) 二奎啉甲酸法（BCA）試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，并制定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。制作8%濃縮膠及12%分離膠。蛋白樣品煮沸變性后，取30 μg上樣，進(jìn)行濃縮及電泳分離，分離電壓120 V，濕法轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯（PVDF）膜。2% BSA室溫封閉1 h，一抗工作液（兔抗人NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9及GAPDH多克隆抗體，稀釋度：1:500）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）稀釋度1:1 000）室溫孵育1 h，加入化學(xué)曝光液后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并根據(jù)Quantity one軟件分析電泳條帶灰度值。

1.9 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NNMT在食管癌及癌旁正常組織中的表達(dá)NNMT在食管癌組織（59/84，70.23%）中的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（4/84，4.69%）（χ2＝76.825，P＜0.05）。

2.2 siRNA NNMT轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè) Realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，siRNA組NNMT mRNA表達(dá)量下調(diào)[(0.56±0.05) vs (1.00±0.10)，t＝5.903，P＜0.05]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，siRNA組NNMT蛋白表達(dá)量下調(diào)[(0.74±0.07) vs (1.56±0.16)，t＝7.321，P＜0.05]。

2.3 siRNA NNMT對(duì)EC9706食管癌細(xì)胞活力、凋亡及侵襲能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，siRNA組細(xì)胞活力降低[(0.39±0.04)vs (0.62±0.06)，t＝5.832，P＜0.05]。Hoechst染色結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，siRNA組細(xì)胞凋亡率提高[(32.46±3.24)% vs (3.31±0.32)%，t＝6.431，P＜0.05]。Transwell結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)目減少[(32.47±3.25) vs(189.32±18.90)，t＝6.321，P＜0.05]。

2.4 siRNA NNMT對(duì)EC9706食管癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，siRNA組Wnt1a[(0.41±0.04) vs (0.15±0.01)，t＝5.842，P＜0.05]、β-catenin[(0.34±0.03) vs (0.17±0.02)，t＝5.216，P＜0.05]、CyclinD1[(1.12±013)vs (0.39±0.04)，t＝6.438，P＜0.05]、MMP-9[(0.87±0.09) vs (0.31±0.03)，t＝5.128，P＜0.05]表達(dá)量均下調(diào)。

3 討論

NNMT基因最早被學(xué)者通過cDNA技術(shù)在肝組織中鑒定出來，并位于11號(hào)染色體，有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，總長(zhǎng)度約有16 500 bp。NNMT主要位于細(xì)胞質(zhì)中，且在正常情況下高表達(dá)于肝臟組織中，而在心、肺、腎等其它組織中低表達(dá)。NNMT是體內(nèi)重要的甲基化酶，能夠參與多種藥物和外源化合物在肝臟組織中的生物轉(zhuǎn)化，對(duì)肝臟的解毒功能起重要作用。近些年來研究[3-5]發(fā)現(xiàn)NNMT在腎癌、腸癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，可能成為腫瘤診斷新的標(biāo)記物。Xu等[7]研究結(jié)果證實(shí)胰腺癌癌組織中NNMT表達(dá)量高于癌旁組織，Pozzi等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NNMT在膀胱癌組織中活性顯著上升，Song等[9]研究結(jié)果表明NNMT在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)。說明NNMT可能作為癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究采用免疫組化檢測(cè)84 例食管癌組織及癌旁正常組織的NNMT表達(dá)，結(jié)果表明癌組織中NNMT陽(yáng)性率顯著高于癌旁正常組織，與NNMT在其它腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致[7-9]，從而說明NNMT可以作為癌基因參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

另外有眾多學(xué)者[10-11]發(fā)現(xiàn)NNMT表達(dá)量的改變對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響極為顯著。因此本研究繼續(xù)探討NNMT對(duì)EC9706食管癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響，結(jié)果表明NNMT表達(dá)量下調(diào)后顯著降低EC9706細(xì)胞活力，提高細(xì)胞凋亡率，減少細(xì)胞侵襲數(shù)目。腫瘤的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為與多種信號(hào)通路有關(guān)[12-13]。Wnt信號(hào)通路在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，對(duì)胚胎形成、干細(xì)胞形成、分化過程及細(xì)胞增殖等生命過程起調(diào)節(jié)作用。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典信號(hào)通路及非經(jīng)典信號(hào)通路，前者為Wnt/β-catenin，此信號(hào)通路中Wnt1a、3a、7a與卷曲蛋白、LRP5/6形成復(fù)合物，后通過一系列信號(hào)傳遞過程，使β-cateinin復(fù)合體降解，在細(xì)胞胞質(zhì)中大量積累，并進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)控靶基因表達(dá)（CyclinD1、MMP-9）。而且Wnt/β-catenin信號(hào)通路在包括食管癌中均被異常激活，因此阻斷此信號(hào)通路成為多種抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)[14-15]。所以本研究繼續(xù)探討NNMT下調(diào)后對(duì)Wnt/β-catennin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明NNMT下調(diào)后能顯著地下調(diào)EC9706食管癌細(xì)胞Wnt1a、β-catenin、CyclinD1及MMP-9表達(dá)。

綜上所述，NNMT在食管癌組織中高表達(dá)，下調(diào)NNMT表達(dá)量能顯著降低EC9706細(xì)胞活力及侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)CyclinD1及MMP-9表達(dá)，與阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。后期，我們將進(jìn)一步行動(dòng)物荷瘤實(shí)驗(yàn)，深入探討和驗(yàn)證NNMT與食管癌生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系，以期能找到新的食管癌預(yù)后判斷預(yù)測(cè)因子，并為開發(fā)新的有潛力的治療策略奠定理論基礎(chǔ)。