柱前衍生高效液相色譜法測定鹽酸苯海索中甲醛

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（江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司 江蘇 223003）

前言

鹽酸苯海索通過阻斷紋狀體的膽堿能神經(jīng)通路，恢復(fù)帕金森病患者腦內(nèi)多巴胺和乙酰膽堿的平衡，從而改善患者的帕金森病癥狀，是中樞抗膽堿抗帕金森病藥。

鹽酸苯海索的合成以哌啶鹽酸鹽，多聚甲醛，苯乙酮，氯代環(huán)己烷為起始物料，經(jīng)多步反應(yīng)得到鹽酸苯海索[1]。

起始物料多聚甲醛在酸性條件下解聚產(chǎn)生甲醛。甲醛具有強烈的致癌和致畸性，是一種基因毒雜質(zhì)，毒性效應(yīng)終點多樣、危害閾值低，因此對其控制至關(guān)重要。目前藥品中微量甲醛的測定方法有分光光度法、熒光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜法等方法。分光光度法誘導(dǎo)期長，抗干擾能力差；熒光光度法由于很多物質(zhì)自身不能發(fā)射熒光；色譜法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、自動化程度高，HPLC-MS及GC儀器設(shè)備昂貴。采用HPLC色譜法測定甲醛時，甲醛極性較大，出峰早，在紫外檢測器中吸收非常弱，所以通過衍生化反應(yīng)引入強紫外吸收的基團(tuán)，通過測定衍生物含量間接測定甲醛殘留量。在酸催化的作用下，2,4-二硝基苯肼與甲醛反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙，經(jīng)過流動相的洗脫，在柱子上會有保留，所以本文采用2,4-二硝基苯肼對甲醛衍生化，通過測定2,4-二硝基苯腙測定鹽酸苯海索中甲醛含量。衍生化反應(yīng)如圖1。

圖1

根據(jù)鹽酸苯海索每日攝入最大劑量20mg，用非常保守的方法TTC值（1.5μg/天）計算，甲醛可接受的濃度限度75ppm（1.5μg·d-1/20mg·d-1）。

1.儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀；氨水（AR）；磷酸（HPLC，ACS），無水乙醇（AR），2,4-二硝基苯肼（AR），乙腈（HPLC，Scharlau），甲醛溶液（AR）；鹽酸苯海索（批號：01，02，03）。

2.方法與結(jié)果

(1)方法

①色譜條件

色譜柱為C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）；以磷酸溶液（取磷酸5.75g，加水稀釋至1000ml，用氨水調(diào)pH值至2.85）-乙腈（50:50）為流動相；檢測波長為336nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl，流速為1.0ml/min。

②溶液配制

空白溶液：精密量取無水乙醇5ml、磷酸溶液（1→50）3ml、2,4-二硝基苯肼無水乙醇溶液（0.05→100）1ml，置10ml量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，放置7小時，作為空白溶液。

取甲醛溶液（使用前按照中國藥典2015年版二部甲醛溶液[含量測定]項下規(guī)定測定含量）適量，精密稱定，用無水乙醇溶解并稀釋制成每1ml中約含15μg的溶液，搖勻，得對照品貯備液I；精密量取1ml，用無水乙醇稀釋制成1.5μg/ml的溶液，搖勻，即得對照品貯備液II。

精密量取對照品貯備液II 5ml，置10ml量瓶中，精密加入磷酸溶液（1→50）3ml、2,4-二硝基苯肼無水乙醇溶液（0.05→100）1ml，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置7小時，作為對照品溶液。

取本品約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法操作，作為供試品溶液。

③測定法

記錄空白溶液和對照品溶液色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算2,4-二硝基苯腙，不得超過75ppm。

(2)方法學(xué)驗證

①專屬性

取本品約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中，精密加入對照品貯備液I 2.5ml，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法操作，作為供試品加標(biāo)溶液。

分別精密量取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液及供試品加標(biāo)溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液、供試品溶液對2,4-二硝基苯腙峰無干擾，2,4-二硝基苯腙峰與相鄰峰分離度良好，本方法專屬性良好。

圖2

②線性

精密量取0.2ml、0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml對照品貯備液I，分別置10ml量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，分別精密量取5ml，置10ml量瓶中，同法配制，作為線性1～8溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以線性濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。回歸方程為A=459.57C+6639.6（R2=0.9997），結(jié)果表明，甲醛在2.977～1488.7ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

③定量限及檢測限

取對照品溶液，加無水乙醇逐步稀釋成不同濃度，分別進(jìn)樣。在信噪比約為10:1時，測得甲醛的定量限濃度為2.977ng/ml；在信噪比約為3:1時，測得甲醛的檢測限濃度為0.595ng/ml。

④重復(fù)性

分別配制6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算6份供試品中甲醛含量，結(jié)果，6份供試品甲醛含量RSD為1.89%，本方法重復(fù)性良好。

⑤回收率試驗

取本品約0.5g，精密稱定，置25ml量瓶中（配制9份，分三組），分別精密加入對照品貯備液I 2.0ml、2.5ml、3ml，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，同法配制成80%、100%、120%加標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣，記錄結(jié)果。甲醛加標(biāo)回收率平均值為90.1%（RSD=1.56%，n=9），此方法準(zhǔn)確度良好。

(3)樣品檢測

取三批鹽酸苯海索，按“2.1”項下方法測定甲醛，甲醛含量分別為1.4ppm（01批）、1.4ppm（02批）、1.6ppm（03批）。結(jié)果表明，三批鹽酸苯海索中甲醛的含量均符合規(guī)定。

3.結(jié)論

本文建立柱前衍生高效液相色譜法，專屬性強、靈敏度高，適用于鹽酸苯海索中甲醛的測定。