針刺對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠“足三里”穴區(qū)HRH2、SP及炎性因子表達(dá)的影響

尹鴻智　趙娟　劉倩　金佳燕　常小榮　鐘歡　劉密

〔摘要〕 目的 觀察針刺對(duì)慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）大鼠及正常大鼠“足三里”穴區(qū)組胺H2受體（histamine H2 receptor， HRH2）、P物質(zhì)（substance P， SP）及炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的影響，并判斷兩者間是否存在差異。方法：將32只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、正常+針刺組和模型+針刺組，每組8只。采用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（1-methyl-2-nitro-1-nitrosoguanidine， MNNG）+乙醇灌胃+饑飽失常法建立大鼠CAG模型。針刺組每日治療1次，每次20 min，連續(xù)針刺14 d。干預(yù)結(jié)束后，運(yùn)用HE染色法觀察胃組織病理學(xué)變化，運(yùn)用免疫組化（immunohistochemistry， IHC）檢測“足三里”局部穴區(qū)HRH2、SP、IL-6、IL-1β及TNF-α的表達(dá)。結(jié)果 造模后胃組織病理形態(tài)改變顯著，光鏡下可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體萎縮且結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生充填，并伴有散在出血點(diǎn)，符合CAG病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。IHC染色I(xiàn)OD值顯示，與正常組相比，模型組、正常+針刺組均能升高局部穴區(qū)HRH2表達(dá)（P<0.01）;與模型組相比，模型+針刺組可以顯著上調(diào)穴區(qū)組織SP表達(dá)（P<0.01）。對(duì)于炎性因子而言，與正常組相比，模型組均能上調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)（P<0.05或P<0.01），正常+針刺組可使IL-6表達(dá)上調(diào)（P<0.01）;與模型組相比，模型+針刺組可以降低IL-6、IL-1β表達(dá)（P<0.05），而升高TNF-α表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 針刺能對(duì)正常和CAG狀態(tài)下大鼠“足三里”穴區(qū)HRH2、SP及炎性因子的表達(dá)產(chǎn)生影響，且所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)具有一定趨勢，跟是否處于疾病狀態(tài)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性萎縮性胃炎;針刺;組胺H2受體;P物質(zhì);炎性因子

〔中圖分類號(hào)〕R245? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.018

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of acupuncture on the expressions of histamine H2 receptor （HRH2）， substance P （SP） and inflammatory factors （IL-6， IL-1β， TNF-α） in the "Zusanli" （ST36） acupoint area of chronic atrophic gastritis （CAG） rats and normal rats， and to determine whether there is any difference between them. Methods 32 SD rats were randomly divided into the normal group， the model group， the normal + acupuncture group and the model + acupuncture group， with 8 rats in each group. The CAG model of rats was established by 1-methyl-2-nitro-1-nitrosoguanidine （MNNG） + ethanol gavage + hunger and satiety disorder. The acupuncture group was treated with acupunctureonce a day， for 20 minutes each time for 14 days. After intervention， the changes of gastric histopathology were observed by HE staining， and the expressions of HRH2， SP， IL-6， IL-1β and TNF-α were detected by immunohistochemistry （IHC）. Results The pathological morphological changes of gastric tissues were significant after the model construction. Under light microscope， a large number of inflammatory cells could be seen， the glands were atrophied and disorganized in structure， and the fibrous tissue was proliferated and filled， accompanied by scattered bleeding points， which met the CAG pathological diagnostic criteria. The IOD value of IHC staining showed that compared with the normal group， the expression of HRH2 of local acupoint area was increased in the model group and normal + acupuncture group （P<0.01）; compared with the model group， the model + acupuncture group significantly increased the expression of SP of acupoint area （P<0.01）. For inflammatory factors， compared with the normal group， the model group increased the expressions of IL-6， IL-1β and TNF-α（P<0.05）， and the expression of IL-6 in the normal + acupuncture group could be up-regulated （P<0.01）; compared with the model group， the expressions of IL-6 and IL-1β in the model + acupuncture group were decreased （P<0.05）， while the expression of TNF-α was increased （P<0.01）. Conclusion Acupuncture can affect the expressions of HRH2， SP and inflammatory factors in the "Zusanli" （ST36） acupoint area of rats under normal and CAG pathological conditions， and the biological effect has a certain trend， which is related to whether the rats are in the state of disease.

〔Keywords〕 chronic atrophic gastritis; acupuncture; histamine H2 receptor; substance P; inflammatory factors

《丹溪心法》記載：“欲知其內(nèi)者，當(dāng)以觀乎外;診于外者，斯以知其內(nèi)。蓋有諸內(nèi)者，必形諸外”，說明體表皮膚與內(nèi)在臟腑密切相關(guān)。慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是一種主要表現(xiàn)為上腹部疼痛、脹滿、厭食、噯氣等非特異性癥狀的常見消化系統(tǒng)疾病[1-2]。其病理特征以胃黏膜病變?yōu)橹鳎１憩F(xiàn)為胃黏膜萎縮、胃上皮異型增生、腸上皮化生等，CAG被認(rèn)為是胃癌的癌前病變階段[3-4]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們面臨快節(jié)奏的生活方式、飲食習(xí)慣，導(dǎo)致CAG發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡低齡化趨勢明顯，且預(yù)后逐漸不佳，故采取積極有效的方法防治 CAG 是防止其癌變的關(guān)鍵[5-6]。針灸防治CAG有著悠久的歷史，且具有很大的優(yōu)勢[7]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察針刺對(duì)于CAG大鼠及正常大鼠“足三里”穴區(qū)組胺H2受體（histamine H2 receptor， HRH2）、P物質(zhì)（substance P， SP）及相關(guān)炎性因子的影響，并判斷兩者間是否存在差異，為臨床CAG的中醫(yī)外治干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與臨床思路。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)成年SD雄性大鼠32只，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、正常+針刺組、模型+針刺組，每組8只。實(shí)驗(yàn)過程中的操作和動(dòng)物處置均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中的相關(guān)規(guī)定。

1.2? 主要試劑及儀器

1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（1-methyl-2-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG）（東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，75F7I-TF）;Histamine H2 receptor抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab215992）;Substance p抗體（Proteintech公司，貨號(hào)：13839-1-AP）;IL-6抗體（Proteintech公司，貨號(hào)：66146-1-Ig）;IL-1β抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab208113）;TNF-α抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab109322）。電子秤（上海佑科儀表有限公司，YP10002）;電子天平（德國Sartorius公司，BA 110S）;組織病理包埋儀（德國徠卡公司，EG1160）;組織病理切片機(jī)（德國徠卡公司，RM2135）;電子顯微鏡（日本尼康公司，ECLIPSE Ti-S）;針灸針（蘇州針灸用品有限公司，0.25 mm×25 mm）。

1.3? 模型制備及評(píng)定

采用MNNG聯(lián)合法（MNNG+乙醇灌胃+饑飽失常法）復(fù)制CAG大鼠模型[8-9]。取5 g MNNG配成濃度為1 g/L的原液（儲(chǔ)存液），用錫箔紙包裹后置于4 ℃冰箱避光冷藏，造模第1天用原液配成170 μg/mL的MNNG 溶液，按1 mL/100 g灌胃1次，隨后用原液配150 μg/mL的MNNG飲用液，裝于錫箔紙包裹的飲水瓶中，供大鼠自由飲用，隔24 h更換1次。另將無水乙醇混合清水配成濃度為40%的溶液，按照大鼠體質(zhì)量1 mL/100 g的量，每周灌胃2次，模擬長期飲酒的習(xí)慣。同時(shí)，配合單雙日饑飽失常法，即單日標(biāo)準(zhǔn)飼料足量喂食，雙日禁食，反復(fù)交替。綜合上述方法造模持續(xù)12周。CAG模型成功標(biāo)準(zhǔn)：HE染色見胃組織黏膜固有層固有腺體萎縮[10-11]。

1.4? 干預(yù)方法

正常組正常喂養(yǎng)，模型組12周后標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，兩組均只進(jìn)行抓取、捆綁，每日1次，每次20 min，持續(xù)14 d。

正常+針刺組、模型+針刺組在12周后標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，并予針刺干預(yù)。選取雙側(cè)“足三里”穴，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]，足三里位于大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下緣5 mm處，脛腓骨之間。以75%酒精消毒后，用1寸（0.25 mm×25 mm）無菌毫針直刺，深度為5 mm，刺入后持續(xù)捻轉(zhuǎn)20 s，并留針20 min，治療期間以及取針時(shí)各捻轉(zhuǎn)20 s，每日1次，持續(xù)14 d。

1.5? 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

1.5.1? HE染色觀察胃黏膜病理變化? 于干預(yù)14 d后運(yùn)用HE染色法檢測。取材前禁食，將各組大鼠用10%水合氯腹腔注射麻醉后摘取全胃，剪開胃部并將其內(nèi)面外翻，以預(yù)冷（0 ℃）生理鹽水沖洗，取胃黏膜病變最明顯處（約1.0 cm×0.5 cm）作為標(biāo)本，將其放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h后，將標(biāo)本梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚4 μm），經(jīng)HE染色后置光鏡下觀察。

1.5.2? 免疫組化（immunohistochemistrym， IHC）法檢測“足三里”穴區(qū)HRH2、SP及炎性因子表達(dá)? 大鼠腹腔麻醉后取右側(cè)“足三里”穴區(qū)皮膚組織（約5 mm×5 mm×5 mm），常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟，抗原修復(fù)，3% H2O2滅活，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，予中性樹膠封片及顯微鏡觀察，并采用電腦采像，圖像分析軟件IPP（Image-Pro-Plus）測得IOD值。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各檢測指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，經(jīng)檢驗(yàn)滿足正態(tài)性及方差齊性采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法，不滿足方差齊性則采用Tamhanes T2法;不滿足正態(tài)性分布采取秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠胃組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

光鏡下正常組胃黏膜層和肌層厚度正常，腺體豐富，上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜無充血、水腫;而模型組可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，固有腺體萎縮且結(jié)構(gòu)紊亂，數(shù)量減少，大量主細(xì)胞壞死空泡樣變化，纖維組織增生充填，并伴有散在出血點(diǎn)，符合CAG病理診斷;正常+針刺組與正常組在光鏡下無明顯差異，但黏膜下可見部分炎細(xì)胞浸潤;模型+針刺組胃黏膜及黏膜下層有可見的炎性細(xì)胞浸潤，伴有散在的出血點(diǎn)，腺體結(jié)構(gòu)較完整，主細(xì)胞空泡樣變化減輕。詳見圖1。

2.2? 各組大鼠“足三里”穴區(qū)組織HRH2、SP表達(dá)結(jié)果

2.2.1? 各組大鼠穴區(qū)組織HRH2、SP表達(dá)IHC結(jié)果? 各組HRH2除正常組外均呈現(xiàn)高染的結(jié)果，其中模型組表達(dá)程度最高，且模型+針刺組染色程度弱于模型組，而正常+針刺組也能引起組胺受體的表達(dá);對(duì)于SP來說，模型組、模型+針刺大鼠局部SP呈高表達(dá)，正常+針刺組表達(dá)與正常組未見明顯差別。詳見圖2。

2.2.2? 各組大鼠穴區(qū)組織HRH2、SP表達(dá)IOD值? 與正常組相比，正常+針刺組、模型組均能升高局部穴區(qū)HRH2的表達(dá)（P<0.01）;與模型組相比，模型+針刺組可以顯著上調(diào)穴區(qū)組織SP的表達(dá)（P<0.01）。見表1。

2.3? 各組大鼠“足三里”穴區(qū)組織炎性物質(zhì)表達(dá)

2.3.1? 各組大鼠局部穴區(qū)組織IL-6、IL-1β及TNF-α的IHC結(jié)果? 各組大鼠局部穴區(qū)組織炎性物質(zhì)均有表達(dá)，呈黃染或棕染。其中，IL-6正常+針刺組染色強(qiáng)度明顯高于正常組，而模型+針刺組染色強(qiáng)度略低于模型組;而對(duì)于IL-1β，模型組染色強(qiáng)度高于正常組，而模型組與模型+針刺組對(duì)比染色強(qiáng)度相差不大，正常+針刺組較正常組表達(dá)較弱;而TNF-α模型組、正常+針刺組及模型+針刺組較正常組均呈高表達(dá)。詳見圖3。

2.3.2? 各組大鼠局部穴區(qū)組織炎性因子IOD值? 與正常組相比，模型組、正常+針刺組均可上調(diào)局部IL-6的表達(dá)（P<0.01）;與模型組相比，模型+針刺組可以降低IL-6的表達(dá)（P<0.05）。與正常組相比，模型組能顯著上調(diào)局部IL-1β的表達(dá)（P<0.01）;與模型組相比，模型+針刺組IL-1β表達(dá)明顯下降（P<0.05）;同樣，模型組TNF-α表達(dá)明顯高于正常組（P<0.05），與模型組相比，模型+針刺組TNF-α表達(dá)仍進(jìn)一步上升（P<0.01）。見表2。

3 討論

針刺是屬于體表刺激的一種，不同于藥物通過輸入相應(yīng)物質(zhì)來產(chǎn)生效應(yīng)，針刺通過獨(dú)特的機(jī)械刺激，激活相應(yīng)的神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。《素問·皮部論》曰：“其色多青則痛，多黑則痹，黃赤則熱，多白則寒”，說明審查皮膚體表的顏色、形態(tài)變化可以診斷體內(nèi)臟腑疾患?！鹅`樞·刺節(jié)真邪論》云：“凡用針者，必先察其經(jīng)絡(luò)之虛實(shí)，切而循之，按而彈之，視其應(yīng)動(dòng)者，乃后取之而下之”，《靈樞·終始》記載：“審、切、循、捫、按，視其寒溫盛衰而調(diào)之，是謂因適而為之真也”，說明在診察疾病及治療時(shí)可通過循、按、摸、揣等方法尋找皮膚經(jīng)脈淺表的陽性反應(yīng)點(diǎn)，繼而輔之以相應(yīng)干預(yù)手段，或針，或灸，或推拿、拔罐，通過局部皮膚的刺激達(dá)到對(duì)內(nèi)在臟腑乃至整體的調(diào)節(jié)效應(yīng)，這一切充分說明了體表與臟腑是密不可分的。

近年來，隨著皮膚及皮膚神經(jīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌軸、免疫系統(tǒng)之間的交互作用網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)體系建立，Skin-Brain-Axis的現(xiàn)代概念已經(jīng)趨于完備，皮-腦軸學(xué)說認(rèn)為皮膚和中樞神經(jīng)之間有密切的相互作用，并且皮膚、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫炎癥反應(yīng)之間是不可分割的[13]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中Bos曾提出皮膚免疫系統(tǒng)理論，認(rèn)為該系統(tǒng)的功能與神經(jīng)-體液-內(nèi)分泌密切相關(guān)[14]，同時(shí)近些年對(duì)于穴位敏化現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于體表穴位（敏感點(diǎn)）局部的理化環(huán)境，如組胺、SP、瞬時(shí)電位香草酸Ⅰ等受體可以由于內(nèi)臟炎性損傷而呈現(xiàn)高表達(dá)[15-16]，進(jìn)一步證明了體表與臟腑之間聯(lián)系。

SP是一種神經(jīng)肽主要存在于脊髓、腦、腸神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，而皮膚組織中同樣有神經(jīng)肽的表達(dá)，皮膚組織中神經(jīng)肽的表達(dá)既對(duì)皮膚固有免疫細(xì)胞有激活作用，且對(duì)非固有免疫細(xì)胞有趨化作用[17]。SP及其相關(guān)肽不僅起到神經(jīng)遞質(zhì)的功能，而且還是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和內(nèi)分泌的重要因子[18]。本研究結(jié)果提示在CAG狀態(tài)下，針刺可以明顯上調(diào)局部穴區(qū)SP的表達(dá)，而在正常狀態(tài)下調(diào)控不明顯，預(yù)示著針刺對(duì)于局部穴區(qū)組織SP的影響存在一定趨向性。

組胺是由L-組氨酸經(jīng)組氨酸脫羧酶脫羥而產(chǎn)生，存在于多種細(xì)胞中，在皮膚組織中主要來源于肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞激活脫顆粒后釋放組胺，與局部組織特異性受體結(jié)合發(fā)生變應(yīng)性炎癥反應(yīng)。組胺特異性受體中H2受體能引起皮膚黏膜充血、水腫和瘙癢等，因此，HRH2在皮膚炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[19-20]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在CAG模型狀態(tài)下，針刺對(duì)于HRH2的影響并不顯著，而在正常狀態(tài)下可以增加局部穴區(qū)HRH2的表達(dá)，這可能預(yù)示著在正常狀態(tài)下針刺通過激活局部穴區(qū)組織的肥大細(xì)胞釋放組胺，反應(yīng)性引起HRH2的表達(dá)，從而引起局部穴區(qū)組織炎癥反應(yīng)。由此說明針刺的作用效應(yīng)可能在疾病與非疾病狀態(tài)下存在一定差異。

IL-1β、IL-6、TNF-α是一組與組織損傷和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的促炎因子，IL-1β是一種多肽類細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)中屬于關(guān)鍵的細(xì)胞介質(zhì)[21]，主要通過免疫上調(diào)及促炎癥活動(dòng)來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。IL-6可以通過與IL-6受體（IL-6R）和蛋白質(zhì)gp130的結(jié)合激活JAK/STAT信號(hào)通路、SHP-2/ERK MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮多樣的生物學(xué)作用，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)[22]。TNF-α也在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，可由局部組織中單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α的增多可產(chǎn)生趨化性細(xì)胞因子，引起局部循環(huán)中中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，從而遷移和外滲至局部組織[23]。IL-1β、IL-6、TNF-α之間協(xié)同作用共同介導(dǎo)著炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出在CAG狀態(tài)下IL-1β、IL-6與TNF-α的表達(dá)較正常時(shí)顯著升高，說明大鼠在CAG狀態(tài)下局部穴區(qū)組織已經(jīng)處于一種炎癥狀態(tài)，而經(jīng)過針刺干預(yù)后IL-6、IL-1β明顯下降，表明針刺可以減少一定炎癥反應(yīng);在正常情況下，針刺后IL-6升高，而IL-1β、TNF-α變化不明顯，可能是由于針刺屬于一種物理刺激法，可造成一定機(jī)械損傷，從而激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，但并非病原體感染，因此，機(jī)體免疫系統(tǒng)此時(shí)并未激活，而皮膚組織中存在的角質(zhì)形成細(xì)胞能分泌產(chǎn)生IL-6，故針刺后只有IL-6升高。綜合上述3種炎性因子在正常及CAG狀態(tài)下的表達(dá)，說明針刺足三里對(duì)于炎性因子的表達(dá)具有一定的趨向調(diào)節(jié)作用，即既能促進(jìn)相應(yīng)炎性因子的表達(dá)，發(fā)揮促炎作用;也能下調(diào)炎性因子的表達(dá)，以達(dá)到抗炎作用。

本研究通過設(shè)置正常+針刺組與模型+針刺組，對(duì)比探討針刺在不同狀態(tài)下對(duì)相關(guān)神經(jīng)肽、組胺及炎性因子表達(dá)的影響是否具有差異性，為CAG針刺治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。通過HE染色可知針刺對(duì)于胃黏膜組織具有一定修復(fù)作用;而IHC及IOD值分析，明確了在CAG狀態(tài)下，足三里局部穴區(qū)已處于一種炎癥狀態(tài);并初步探知了針刺干預(yù)能對(duì)足三里局部穴區(qū)SP、HRH2及相關(guān)炎性因子的表達(dá)產(chǎn)生影響，且所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)具有一定趨勢，跟是否處于疾病狀態(tài)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同狀態(tài)下，針刺作用的影響及差異，而未涉及產(chǎn)生差異潛在的作用機(jī)制，這也有待下一步進(jìn)行深入研究。

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